家禽血凝—血凝抑制试验的实验室监测操作

血凝（HA）—血凝抑制（HI）试验是家禽养殖场抗体监测的主要方法，这种检测方法是对免疫工作的一个检验。根据实验室抗体检测结果可以确定相关疫苗的免疫剂量和免疫时间，是在动物疫病防控实践中最具针对性、科学性的举措，标志着免疫工作的成败，也是指导养殖场（户）制定科学合理的免疫程序的一个重要依据，是动物疫病防控的基础和关键。

近年来，兽医生物实验室在不同规模的养殖企业相继建立，但普遍存在化验员素质不整齐，化验操作不规范、化验结果不准确等现象。为了指导基层兽医实验室人员能更有效准确地做好抗体检测工作，针对实验室操作中易忽略的一些问题，现以禽流感、新城疫抗体检测过程为例，说明在实验操作过程中应注意的事项，供读者参考。

1. 实验用品的消毒

除一次性用具外，其余所有实验用品均应消毒。如稀释瓶、移液管、稀释棒等；稀释液和抗凝剂若是自己配置的，必须高压灭菌后再放于4℃备用。

2. 样品的采集要具有代表性

所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。

3. 1%红细胞的制备、保存及注意事项

严格来说必须采用SPF（无特定病原）公鸡的红细胞，但介于实际情况，通常采用非免疫鸡的红细胞，血凝实验（HA）中所用的红细胞与随后的血凝抑制实验（HI）中所用的红细胞必须来自同一只未免疫鸡，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。

新鲜红细胞不易长期保存，容易发生溶血，因此红细胞现用现配效果最佳，也可将红细胞配成10%的浓度于4℃保存，但最多不超过48h，使用时再稀释为1%。稀释过程中，红细胞的量依据移液管读数时，应遵循“宁读少勿读多”原则，因为在将红细胞用移液管或枪头吸入稀释瓶后，会有少量滞留在移液管壁或枪头内壁，使得实际使用的红细胞量和理论值存在差异，最终造成红细胞稀释浓度偏低，影响结果的判定。实验后剩余的1%红细胞，应弃去，切勿保留至下次再用。

4. 四单位抗原制备要准确

要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。制备好的四单位抗原还需要进行验证以保证试验的准确性。

5. 加样时需注意

不论是在HA中，倍比稀释了抗原以后，还是在HI中，倍比稀释了被检血清以后，再加任何液体全部采用，先加对照孔、其次按低浓度孔向高浓度孔的顺序添加，也就是常说的“从后往前加”。这样做是为了减少加样时，枪头难免粘到前一个孔内液体后，再将其带入下一孔中而引起的误差。

此外，倍比稀释时避免孔中液体起大量泡沫；若用不同稀释棒同时稀释不同孔时，避免稀释棒相互接触。

6. 移液枪头的及时更换

HA在最后一步加红细胞，或HI在最后两步，加稀释好的抗原和红细胞时，必须做到不同被测组加以上液体时，“换组即换枪头”。切不可为了省事“一个枪头从头用到尾”。

7. 反应温度

待实验操作完毕，等待结果的20～30min，环境及温度的选择也是非常重要的。温箱温度虽然可调、可控且易于操作，但最好置于室温（18～20℃）下，若室温无法满足时再放于温箱。多次实践证明，同一被检血清，其他条件均一致的前提下，放于温箱内最终滴度通常比放于室温下高一个滴度。

8. 标准抗原、阳性血清的影响

使用过期的标准抗原、阳性血清等也会影响实验结果的准确性，也应在实验过程中引起注意。

9. 结果判读时需要注意

结果判定需及时性：每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。

对于初学者，结果判读时，可将血凝板倾斜45°角，根据孔底的红细胞流动现象，判定是否凝集。凡沉于孔底的红细胞，沿着斜面呈线状流下，与红细胞对照孔流动状态一致，则可判定为完全不凝集。切不可平放桌面，模糊误判。