疫病监测

赤羽病病毒检测方法研究进展

日期：08-10 作者：阳光畜牧网- 小 + 大

    3 分子生物学检测
    AKAV 核酸检测以其快速、特异等特点而成为病毒检测的一个重要发展方向。Ohashi S等建立了检测AKAV 的多重RT-PCR方法，此法敏感快速，在细胞培养液中同时可检测牛的5种虫媒病毒病，通过扩增产物的长度即可鉴别。李健等利用BHK-21细胞繁殖AKV美国株，以30 ％蔗糖垫底超速离心浓缩病毒。根据AKAV的S RNA序列，设计合成3对引物，在国内首次建立了检测AKAV的RT-PCR方法，850 bp扩增产物的序列与已知序列同源性 99 ％以上，能够敏感地检测出阳性样品。StramY 等从以色列中部的Volcan的库蠓中用荧光PCR检测到该病毒的S RNA片段，这是首次应用荧光定量PCR技术检测此病。Stram 还报道，用多重实时荧光定量RT-PCR可特异性地检测和定量AKAV和AINV（ Aino virus，AINV）。张吉红等根据GenBank中已发表的AKAV的S基因序列，设计了3条特异性引物，建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明，该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段，但从牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、传染性牛鼻气管炎病毒（ IBRV）等13 种对照病毒中均不能扩增出目的条带。敏感性试验表明，套式RT-PCR能够扩增10-5稀释度的病毒RNA（核酸含量约1.18 ng/μL) ，比普通RT-PCR高出l 000倍。用此方法检测 130 份奶牛血清样品与 l 份流产胎儿病料，均未检测到阳性样本，但AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。研究结果表明，该方法灵敏、特异，为AKAV的检测提供了一个快速、有效的手段。张吉红等也建立了Real-time RT-PCR方法。该方法与套式RT-PCR一样敏感特异，而且Real-time RT-PCR无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了试验人员的安全，且在检出时间上比普通RT-PCR提前2~3 h得出结果，可为AKAV的流行病学调查和诊断提供有力的技术支持。鱼海琼等根据赤羽AKAV S基因的6个特异区域设计了2对引物，首次建立了AKAV环介导等温扩增（LAMP）检测方法，对LAMP反应条件进行了优化，并将其与普通PCR方法进行比较。结果显示，LAMP 检测方法的特异性好，只对AKAV进行扩增，且操作简便。该方法为AKAV的一种最新的快速、简便的检测方法，可用于出入境牛、羊赤羽病的快速检测。
    近年来，人们逐渐对赤羽病的流行病学特点、发生机理、病原检测、血清学诊断和分子生物学检测等方面的研究有了一定的进展，但是很长时间以来，在进境动物实验室检疫工作中，仍缺乏一种敏感、快速、准确的方法。目前国内普遍采用的方法是微量血清中和试验法，该方法主要依据细胞是否出现病变来判定结果，在检疫实践过程中，常常因为细胞病变不明显或毒价过低而使该病的检疫变得棘手。随着全球性气候变暖、蚊虫生存密度和栖息地的变化，可能会增加本病传播和发生的机会。因此，研究人员正在致力于研究新的简便、易行，具有高度特异性和敏感性，结果判定能够标准化，且适宜于大规模检测的方法，以提高对本病的诊断和监测能力。
    参考文献（略）
    本文作者：庄金秋，沈志强（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

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