疫病监测
赤羽病病毒检测方法研究进展
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2.2 血凝抑制试验（HI） AKAV能凝集雏鸡、鸽、鸭和鹅的红细胞，该凝集反应可被感染AKAV的动物血清抑制。Ito H等发现用甲醛处理过的鹅红细胞代替新鲜的鹅红细胞，能提高红细胞的凝集性，并且不依赖盐浓度，这样方便了对AKAV的免疫学研究。抗凝剂肝素会抑制 AKAV 的血凝活性，肝素结合AKAV的血凝成分，而不是红细胞，所以，用肝素化的细胞分离AKAV，并不理想。 2.3 微量血清中和试验（SN） 康复动物及新生而未吃初乳的仔畜血清中存在能中和AKAV的抗体。将已知 AKAV 与可疑动物血清混合后接种于l~2日龄小鼠脑内或7～9日龄鸡胚的卵黄囊内，该试验也可在Vero、Hmlu-1和BHK-21等敏感细胞上进行。刘焕章应用引自日本的AKAV，制备了微量病毒中和试验抗原和高免血清，建立了赤羽病微量病毒中和试验诊断方法。应用此法对广东省 724 头牛血清进行检查，阳性率35.3 ％，对上海665头牛血清作检查，阳性率67.7 ％，说明这些地区曾流行过赤羽病；同时对澳大利亚当地108头牛进行检查，阳性率55.5 ％，与报道一致。对澳大利亚、加拿大、美国进口牛 173 头的检查结果全部为阴性，对澳大利亚进口992只羊的检查结果发现阳性1只，已得到澳方认可。微量血清中和试验成功的关键是抗原的纯度和效价及标准阳性血清的质量。该法为目前我国进口种畜中AKAV主要检测方法，系农业部行业标准。但病毒中和试验中细胞易受污染，检测周期较长。 2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） 日本的Ide S等首次建立了检测牛血清中AKAV抗体的ELISA方法。李健等应用AKAV OBE-1株和牛标准阴阳性血清，以蔗糖密度梯度离心纯化的细胞毒为包被抗原，在国内首次建立了检测AKAV抗体的间接ELISA方法，结果表明该方法具有快速、待检样品不需灭活、特异性和敏感性也较高的特点。花群义等应用N基因表达的核蛋白抗原建立了间接ELISA方法，用重组核蛋白抗原代替完整病毒作为ELISA检测用的标准抗原，克服了用全病毒所带来的生物安全隐患。该法具有较高的特异性和敏感性，已经作为我国进口种畜AKAV的检测方法。鱼海琼等用AKAV的单克隆抗体建立了阻断ELISA检测赤羽病病毒血清抗体。Brenner 等用AKAV的中和单抗通过竞争ELISA检测牛血清中的AKAV抗体。286 份牛血清先用血清中和试验检测，再用竞争ELISA检测，竞争ELISA的相对特异性高于98%，而单个单抗的相对敏感性在49.0 %~82.2 %之间，表明竞争ELISA可作为检测AKAV抗体的快速和特异性方法，且有可能替代血清中和试验。Tsuda等用G蛋白的2个单克隆抗体建立了竞争EL1SA检测方法，具有更高的特异性。徐树兰等以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原，建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法，初步组装成便于使用的试剂 盒。经对试验条件进行优化，确定最佳抗原包被量为每孔1 μg（100 μL），样品稀释度1∶100，兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的 100 份牛血清样本进行了检测，以中和试验为参照，经统计学处理，得出检测临界值分别为0.411和0.303，2种方法的符合率分别为 72.7 % （56/77）和91.4 %（85/93）。试剂盒在 37℃保存 3d，对敏感性无明显影响。 2.5 间接荧光抗体试验（IFNT）李少英等以兔抗赤羽病重组核蛋白血清作一抗，利用间接荧光抗体法在AKAV感染的BHK-21培养细胞和攻毒的乳鼠脑组织中特异性地检测到了AKAV抗原，此法特异性高且操作时间短。 2.6 补体结合试验（CFT）可用常规的补体结合试验来检测AKAV的特异补体结合抗体。主要用于辛波病毒群之间关系比较，用于确定布尼亚病毒群血清学亚群。 2.7 胶体金免疫层析技术 杨素等采用双抗体夹心免疫层析技术，研制了适合田间快速试验的赤羽病胶体金免疫层析试纸条。纯化AKAV单克隆抗体3A和2C，用柠檬酸钠还原法制备胶体金标记纯化后的单抗作为标记抗体。分别将羊抗鼠IgG和纯化后的单抗包被于NC膜上作为质控带和检测带，以检测被检样品中的AKAV。试验结果表明，所研制的试纸条敏感性较高（为10 TCID），特异性较强，还具有快速、稳定、简便等特点，适合基层动物防疫检疫部门尤其是进出境动物检疫机构进行赤羽病大批量、田间快速初筛，对赤羽病快速诊断具有重要的意义。张吉红等以亲和层析原理为基础，将提纯的AKAV抗原包被在硝酸纤维膜上，利用胶体金标记SPA显色，建立了斑点免疫金渗滤法（DIGFA）诊断赤羽病抗体的方法。其中最佳点样抗原质量浓度0.099 ms/mL，封闭液选择含1 ％BSA ，0.5 ％Tween-20的0.01 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液，SPA胶体金最佳稀释度为1∶4。特异性试验表明，该方法特异性好，与牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎、牛白血病、口蹄疫、蓝舌病等阳性血清不发生交叉反应，特异性良好，而其检测的敏感性与ELISA基本相同。该方法检测不需要特殊设备，操作简单，结果易于判断，适用于进出口检疫及基层动物防疫。 |
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