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5)加底物溶液,同间接法8)。
6)同间接法9)。
7)同间接法10)。
③结果判定 常用的判定方法有3种。
阴阳性表示法：待检样本吸收值：规定吸收值≥0.2－0.4 为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD(标准差)。
阳性阴性比(P/N)法：样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2－3者为阳性。
终点表示法：以出现阳性反应的样本最高稀释度为该样本的滴度。
④注意事项
第一,包被过程中以高pH值和低离子强度的条件为佳，包被浓度在1－100毫克/毫升选择最佳浓度。
第二,血清或抗原稀释液应含5%－10%异种动物血清, 或1%牛血清白蛋白,或0.5%明胶,以起封闭作用,防止非特异性反应,否则应在2)与3)步之间加封闭液进行封闭。
第三,洗涤要充分,酶结合物应按要求进行稀释和使用, 底物溶液一定要现配现用。
第四,显色时,阴性对照刚出现微黄色时应立即终止反应。.
第五,用阳性阴性比方法判定结果时,阴性对照孔若小于0.1,则易出现误判。
第六,用自动酶联仪检测时，应按仪器规定说明确定调零孔。
第七,同一稀释度2个孔的490纳米波长光密度值的平均值为该稀释度的光密度值,对照孔应做同样处理。
(3)猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验
①材料 本试验的试剂盒由中国兽药监察所提供,本抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原,分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。同时提供酶标抗体,阳性、阴性血清,酶联板及其他器材和试剂。
②试验方法
第一,用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作l00倍稀释,以l00微升分别加入做好标记的酶联板孔中,置湿盒于4℃过夜。
第二,弃去孔内液体,用洗涤液冲洗板3次,每次间隔3－ 5分钟,拍干。
第三,用稀释液将待检血清作400倍稀释,每孔加入100 微升,同时将猪瘟阳性、阴性血清以100倍稀释作对照,37℃下培育1.5－2小时。
第四,重复第二步。
第五,用稀释液将兔抗猪免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释,每孔加入100微升,37℃下培育1.5－ 2小时。
第六,重复第二步。
第七,每孔加入底物溶液(每块板所需的底物溶液按邻苯二胶5毫克加底物缓冲液5毫升加30%双氧水18.75微升配制)100微升,室温下观察显色反应(一般阴性对照孔略微显色,立即终止反应,并以阴性孔作空白调零)。
第八,每孔加入终止液50微升,于酶联读数仪上测定490纳米波长的光密度(OD)③判定标准
在猪瘟弱毒酶联板上：
光密度>0.2为猪瘟弱毒抗体阳性,
光密度<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性。
在猪瘟强毒酶联板上：
光密度≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性；
光密度<0.5为猪瘟强毒抗体阴性。
④注意事项
第一，运输单抗纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输。
第二,配制洗涤液时,应使用新鲜蒸馏水或无离子水；每次洗板后,尽量不使孔中有残余液体,以免影响结果。
第三,底物溶液临用前配制,待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加双氧水,混匀后立即加入孔中。
第四,终止反应后,应立即读数。
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