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免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合的功能,以酶作标记物,利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的,它既可用于抗原的诊断,也可进行血清抗体的检测。
本试验是通过化学方法将酶与抗体(或抗原)结合起来, 标记后的抗体(或抗原)仍然保持与相应抗原(或抗体)相结合的免疫学活性。例如,酶抗体与相应抗原结合后,形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时,催化底物分解、氧化而生成有色物质,有色产物的出现,客观地反映了酶的存在,根据有色产物的有无及其浓度,即可间接推断被检抗原或抗体是否存在及其数量,达到定性和定量的目的。
免疫酶技术已经广泛地用于传染性疾病的诊断,血清流行病学调查和抗体水平的评价,微生物抗原的检测及其在感染细胞内的定位。
目前在兽医防治的研究和实践中,对于猪瘟、伪狂犬病、 繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病, 均采用免疫酶技术进行病原诊断，抗体检测和血清学流行病调查,并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。
利用免疫酶技术测定抗原或抗体的方法很多，下面仅简要介绍两种适合猪场使用的免疫酶技术。
(1) 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)
①材料 硝酸纤维滤膜(孔径0.45微米),0.01摩/升、 pH值7,2的磷酸盐缓冲盐水,封闭液(磷酸盐缓冲盐水加入 10%马血清或0.1%明胶),30%双氧水(H2O2),3,3′-二氨基联苯胺(DAB)抗原液,阴性对照,待检液,待检血清,阳性血清及阴性血清,酶标免抗猪免疫球蛋白G(IgG),0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液,洗涤液(磷酸盐缓冲盐水加入 0.05%吐温-20)。
②操作
检测抗原
1)硝酸纤维滤膜(NCM)的处理：在滤膜上划6毫米×6毫米的方格,在方格中央用蘸水笔尖的圆尾末端压成圆形痕迹。置于蒸馏水中浸泡10分钟,取出后晾干备用。
2)点样：取1微升待检液在硝酸纤维滤膜圆圈内点样,同时设立阳性与阴性对照,自然干燥或置37℃温箱中干燥。
3)封闭：将硝酸纤维滤膜置于封闭液中,37℃30分钟, 用洗涤液洗涤1次,约3分钟。
4)加工作浓度的猪阳性血清,将硝酸纤维滤膜置于猪阳性血清中,37℃作用1小时,取出用洗涤液洗涤3次,每次3 分钟。
5)加酶标兔抗猪免疫球蛋白G,37℃作用1小时,然后洗涤3-4次,每次3分钟。
6)加底物溶液(0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液 100毫升,加3,3′-二氨基联苯胺40毫克,30%双氧水50微升),作用5－20分钟。
7)终止显色,将硝酸纤维滤膜置于蒸馏水中冲洗2－3分钟
8)自然干燥,或37℃下干燥。
9)判定标准：
"一" 不呈现斑点,与阴性对照相同。
"+" 斑点较弱或点内有不均质的棕色点。
"++" 斑点浅棕色,对比度清晰。
"+++" 介于++和++++两者之间。
"++++" 斑点深棕色,背景白色。
出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的Dot- ELISA效价。
10)注意事项：试验中的点样抗原、血清及酶标抗体的稀释度应根据预备试验确定；试验中应使用不溶性供氢体,如 3,3′-二氨基联苯胺,4-氯-1-萘酚等,不能使用可溶性供氢体； 根据试验的目的要求,确定检测抗原或抗体；封闭液可使用异种动物血清、牛血清白蛋白(BSA)或明胶溶液等进行封闭,根据预备试验选择最佳封闭条件。
检测抗体
1)硝酸纤维滤膜的处理,同检测抗原。
2)点样：取己知抗原液点样,自然晾干或37℃干燥。
3)封闭,同检测抗原。
4)将点样后的硝酸纤维滤膜按点样格子剪成小块,置入系列稀释的待检血清(1：10,1：50,1：100,1 ：200,1 ：400, 1：800,1：1600,1：3200,1：6400,1：12800)中,同时设立阳性和阴性血清对照,37℃作用1小时,然后用洗涤液洗涤3次,每次3分钟。
5)以下均同检测抗原6),7),8),9),10)项操作。
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