云南省牛流行性出血病血清学调查

1.2　病毒

EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10 型参考病毒，由澳大利亚麦克阿瑟 ‧ 伊丽莎白农业研究所（Elizabeth Macarthur Agricultural Institute，EMAI）提供。

1.3 C-ELISA 抗体检测

按照 EHDV C-ELISA 试剂盒说明书，对待检血清进行检测。取 40 μL 稀释液加入 EHDV 抗原包被的 ELISA 板中，分别取 10 μL 被检血清样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照血清，加入到相应检测孔和对照孔中，用振荡器震荡或轻拍微量反应板；将反应板中的液体充分混匀，37 ℃温箱 温育 30 min；取出板，每孔加入 50 μL 1/100 稀释的竞争抗体，充分混匀，37 ℃温箱温育 30 min；取出板，倒掉孔中液体，在吸水纸上拍干；每孔加入 50 μL 1/100 稀释的羊抗豚鼠 HPR 酶标二抗，充分混匀，37 ℃温箱里温育 30 min；取出板，洗 板 5~6 次拍干，加入 TMB 显色液 50 μL/ 孔，37 ℃避光温育 10 min；最后加入终止液 50 μL/ 孔，用ELISA 读板仪 450 nm 波长测定样本和对照的吸光值 OD450。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔OD450 ≤ 0.20，两孔间 OD450 差值＜ 0.05，两个阴性对照孔 OD450 ≥ 1.00 且＜ 1.60，两孔间 OD450 差值＜ 0.20。判定标准：按照抑制率（PI）=（阴性对照 OD450 平均值 - 样品血清 OD450）/ 阴性对照OD450平均值×100%。抑制率≥50%判为抗体阳性，否则为阴性。

1.4　血清型鉴定

从各地 C-ELISA 检出的阳性样品中，随机抽取 18~50 份，利用 EHDV 标准毒株进行微量血清中和试验（SNT），同时参照国家标准 GB/T18636—2017，按 Karber 方法计算 EHDV 7 个血清型标准毒株的半数感染量（TCID50），以确定阳性血清样品的血清型。

1.5　检测结果分析 采用 SPSS 22.0 软件统计各地 EHDV 抗体阳性率，分析各地 EHDV 主要流行毒株血清型。

2　结果与分析

2.1　血清抗体检测

应 用 EHDV C-ELISA 试剂盒，对云南省11 个县市 1 199 份牛血清样品进行抗体检测，检出 EHDV 抗体阳性血清 981 份，抗体阳性率 为 81.8%，各县市均检测到抗体阳性血清，表明牛 EHDV 感染在云南省普遍存在且较严重。各EHDV 抗体阳性率有所差异，其中芒市最高，阳性率达 91.3%，耿马县最低，抗体阳性率仅为49.3%。具体检测结果见表 2。

表 2 2019 年云南省牛 EHDV 血清抗体检测统计结果

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