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酶联免疫吸附试验(ELISA)

时间:2009-12-23    点击: 次    来源:阳光畜牧网    作者:佚名 - 小 + 大

  (2)酶联免疫吸附试验(ELISA)
   本试验是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种测定方法,以物理吸附法制备免疫吸附剂。现介绍猪病诊断中常用的两种方法-间接法和夹心法。
   ①间接法 将已知抗原吸附(或称包被)于固相载体,孵育后洗去未吸附的抗原,随后加入含有特异性抗体的被检血清,感作后洗涤未起反应的物质,加入酶标抗同种球蛋白(如被检血清是猪血清,则需用抗猪球蛋白),感作后再经洗涤,加入酶底物,底物被分解后出现颜色变化,颜色变化的速度及程度,与样品中的抗体量有关,即样品中的抗体愈多,颜色出现愈快、愈深。
  材料:0.05摩/升、pH值9.6碳酸盐缓冲液,稀释液用 0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,5%犊牛血清),洗涤液用0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,0.05%吐温-20),30%双氧水, 邻苯二胺(OPD),pH 值5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,2摩/升硫酸,抗原,阳性血清,阴性血清,待检血清,酶标兔抗猪免疫球蛋白G,40孔聚苯乙烯酶联板,酶联免疫检测仪。
  操作:
  1)用碳酸盐缓冲液配制一定浓度的抗原包被液包被酶联板,每孔100微升,置37℃条件下2小时,或在4℃冰箱内过夜。
  2)倾去孔内液体,用洗涤液加满各孔,洗涤3次,每次3 分钟,然后倾尽洗涤液。
  3)除调零孔外,其余孔加入用稀释液稀释的待检血清,每孔100微升,同时设立阳性、阴性血清对照,置37℃下反应 1.5小时。
  4) 抗体效价测定:将待检血清进行倍比稀释,每份血清加二排孔,即同一稀释度的血清加上下相邻的两个孔,每孔l00微升,调零孔不加血清。同时设立阳性、阴性血清对照。置 37℃反应1.5小时。
  5)洗涤同2)。
  6)除调零孔外,每孔加入酶标记兔抗猪免疫球蛋白G 100微升,置37℃下反应1.5小时。
  7)洗涤同2)。
  8)每孔加入新配制的底物溶液(取邻苯二胺40毫克,溶于100毫升pH值5磷酸盐-柠檬酸缓冲液,临用前加入30% 双氧水0.15毫升)100微升,室温下观察显色(5-30分钟)。
  9)每孔加入50微升2摩/升硫酸终止反应。
  10)用酶联免疫检测仪测定每孔490纳米波长的光密度(OD)值。
  ②夹心法 本法是检测抗原的方法,将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面,然后加入含有抗原的溶液,使抗原和抗体在固相表面形成复合物,洗除多余的抗原,再加入酶标记的特异性抗体,感作后冲洗,加入酶的底物,颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。
  材料:同间接法。
  操作(以检测猪瘟病毒抗原为例):
  1)抗体包被:将一定浓度的猪瘟高免血清(用碳酸盐缓冲液进行稀释)包被酶联板,每孔100微升,置37℃下2小时, 或4℃冰箱中过夜。
  2)洗涤:同间接法
  3)加被检样品,除调零孔外,每份样品加2个孔,每孔加 l00微升,同时设立阳性抗原、阴性抗原对照,酶结合物对照 (抗体加磷酸盐缓冲盐水加酶结合物),置37℃下反应1.5-2 小时。
  4)洗涤,同2)。
  5)加底物溶液,同间接法8)。
  6)同间接法9)。
  7)同间接法10)。
  ③结果判定 常用的判定方法有3种。
  阴阳性表示法:待检样本吸收值:规定吸收值≥0.2-0.4 为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD(标准差)。
  阳性阴性比(P/N)法:样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2-3者为阳性。
  终点表示法:以出现阳性反应的样本最高稀释度为该样本的滴度。

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