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近五年猪圆环病毒3型的研究进展

时间:2023-11-15    点击: 次    来源:北斗农科    作者:王晶晶,王丽萍译 - 小 + 大

6.2 直接检测方法

目前已开发出多种基于PCR的诊断检测方法,包括基于荧光染料掺入法(SYBR Green)的实时qPCR、基于TaqMan的实时PCR和直接PCR,对组织、器官、血清、唾液、鼻拭子和环境样本的检测限均小于102拷贝/μL。微滴式数字PCR具有更高的灵敏度,可检测组织和血清样本中的PCV3,检测限为1拷贝/μL。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等等温扩增方法也已成功开发,可用于检测组织和血清样本,其灵敏度与qPCR相当。最近,利用等温扩增原理的诊断分析(添加指示剂染料甲酚红和苯酚红)实现了血清样本的可视比色检测。

由于PCV3与其他猪源性病毒混合感染的发生率相对较高,一些方法可以在存在其他病原体的情况下检测PCV3。多重qPCR检测法可从组织提取的病毒DNA中检测PCV3及其他PCV和其他病原体,其灵敏度与PCV3的单重qPCR相当。利用双标记(TaqMan)探针开发了一种四重实时PCR检测方法,可同时检测组织样本中的PCV1、PCV2、PCV3和PCV4,其特异性和灵敏度与单重和传统PCR检测方法相当。此外,用于组织样本中PCV2和PCV3双重检测的高灵敏度微滴式数字PCR对PCV2和PCV3的检测限分别为2拷贝/μL和1拷贝/μL。

原位杂交已被用于证实PCV3在可疑病变组织复制。一些检测方法使用RNAScope检测平台,利用探针靶向PCV3 ORF1病毒mRNA的反向补体。其他原位杂交方法利用了PCV3特异性地高辛探针。通过原位杂交或RNAScope诊断PCV3时,提交的组织病理学标本应包括心脏、肺脏、脾脏和淋巴结的样本。PCV3抗体的开发及其在抗原直接检测中的应用一直受到限制,这可能是由于病毒难以分离。不过,也有少数研究利用免疫组织化学和免疫荧光来检测PCV3抗原。PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体与PCV2没有交叉反应,并且在扁桃体和淋巴结上能很好地检测到PCV3抗原。有报道称,在间接免疫荧光检测中使用向BALB/c小鼠腹腔注射PCV3颗粒产生的多克隆抗体,通过细胞培养可确定病毒。

6.3 间接检测方法

为了检测PCV3特异性抗体,已建立了几种ELISA检测方法。密码子优化的全长Cap蛋白已在大肠杆菌表达系统和杆状病毒表达系统中成功表达。与PCV2相似,PCV3 Cap蛋白N端33个氨基酸为核定位信号,具有较多的精氨酸,且密码子少,阻止了蛋白质在原核系统中表达。因此,大多数报道的ELISA使用的是在大肠杆菌中表达的截短Cap蛋白,其核定位信号序列被排除在外。Deng证明,间接ELISA灵敏度高,PCV3特异性IgG的最大稀释度为1∶3 200;同时,未发现与PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV等其他猪源性病毒产生交叉反应。文献报道的ELISA大多数是为评估PCV3特异性IgG而开发的。然而,Mora-Díaz等开发了一种间接ELISA,最早可在接种后7 d检测PCV3特异性IgM。PCV3特异性抗体的血清学评估也是通过使用表达PCV3 Cap或转染重组pcDNA3.1-Cap的杆状病毒进行直接免疫荧光检测来实现的。

7 总结与未来展望

自2016年报道首例由PCV3感染引发的病例以来,该病毒已在全球范围内被广泛报道,并引发了多种临床症状。其中三种主要表现形式不断被报道,并在一定程度上得到了文献的支持:多系统炎症综合征、繁殖障碍和PDNS以及亚临床感染。在大量病例报道中,很难确定PCV3在不同临床表现中的致病作用,原因如下:一是PCV3常与多种病原体混合感染;二是病理学评估不足;三是缺乏原位检测,无法确定病变或感染组织中是否存在病毒基因组或抗原。迄今为止,与PCV3感染有关的重要证据是母猪繁殖障碍、多系统炎症和亚临床感染。

还需要在实验条件下进行进一步的研究,以确定PCV3感染作为引起临床疾病的主要病原体的真实效果。要解决这个问题,关键的一步是要开发实验挑战模型,使其能够再现与田间报道相似的疾病严重程度。目前,关于PCV3混合感染的报道有很多,因此,应将此类混合感染作为引起更严重的PCV3临床疾病的潜在因素进行评估。回顾性研究显示,PCV3已在全球流行了几十年,另一种假设是PCV3可能是PCV2和PRRSV等其他病原体感染的辅助因子,只是PCV3当时尚未被发现。因此,应开发PCV3混合感染模型,以证明PCV3与其他病原体之间的协同作用关系。

持续病毒血症已在实验中得到证实,并在田间研究中得到了确认,这表明存在再感染的可能性。然而,目前还没有阐明PCV3如何导致长期持续感染以及可能会再感染的机制。多项研究表明,PCV3可通过猪的唾液、鼻腔分泌物和粪便排毒;然而,人们对水平传播的机制仍知之甚少。PCV3通过公猪的精液和母猪的初乳进行垂直传播已得到证实,垂直传播的重要证据是在分娩前呈PCV3阳性的后备母猪所产死胎和木乃伊胎中也检测到了PCV3。此外,家猪和野猪群作为PCV3贮存宿主以及跨物种传播的可能性尚未被确定。更好地了解传播途径可以有效地控制和预防疾病。利用PCR可以在多种组织中检测到PCV3,因此,开发针对特定样本类型的更灵敏、更特异的诊断方法是应用不同诊断策略的当务之急。

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