正确认识和应用布鲁氏菌虎红平板凝集试验

2.2　非特异性凝集反应

在体外生理条件（生理 pH 和离子浓度）下，凝集反应还会受到非特异性凝集反应影响。非特异性凝集主要来自两个方面：一方面来自布鲁氏菌抗原与胁清中其他抗原的 IgM 抗体发生非特异性凝集反应。据估计，约 0.6% 无布鲁氏菌感染牛的血清（布鲁氏菌抗体阴性）在 1:100 及以上稀释时，可对光滑型（S 型）布鲁氏菌产生凝集反应。研究表明，没有感染布鲁氏菌的小母牛血清中含有的 IgM，在 ELISA 试验中也可以与布鲁氏菌脂 多糖（LPS）结合，其中与粗糙型菌（R 型）LPS的结合强度比与 S 型菌的高。这一非特异性结合现象在大肠杆菌和假单胞杆菌中也存在。出现非特异性凝集反应的原因是，血清中的非布鲁氏菌抗体IgM 通过其 Fc 部分，能够识别布鲁氏菌和其他革兰氏阴性菌的 LPS 核心脂质 A（lipid A-core）上共有的抗原决定簇。如果抗原悬液中含有裂解的布鲁氏菌，就会加重这种非特异性凝集。另一方面是因为布鲁氏菌胞外多糖（OPS）与一些革兰氏阴性菌的 OPS 存在抗原交叉。在这些细菌中，小肠结肠炎耶尔森氏菌血清型 O:9（Y.O:9）可与布鲁氏菌 OPS 产生强的交叉反应，是布鲁氏菌抗体检测中出现假阳性反应（FPSR）的最常见因素。Y.O:9可感染牛、猪，也可感染绵羊。在反刍动物中，引起布鲁氏菌抗体 FPSR 的细菌可能还有大肠杆菌O:157 和沙门氏菌群 N（O:30），但这些细菌表现出的抗原交叉反应性较低 [8-10]。尽管霍乱弧菌 O:1和一些嗜麦芽窄食单胞菌的 OPS 中也携带有 N- 替 代的过氧胺，但从来没有报道过其在反刍动物中可引起 FPSR。因而，很难确定引起 FPSR 的所有来源。

3　RBT 特性

3.1 酸化处理 RBT 抗原 

为消除凝集反应中的“前带现象”和非特异性反应，人们采取了多种措施，来降低或排除给清 中 IgM 对凝集反应的干扰。常用方法包括：向 清中加入 EDTA 和利凡诺，优先沉淀 IgM；对血清加热，向 清中加入硫醇或酸化胁清，使血清中 的IgM变性。在这些措施中，使血清酸化是消除“前带现象”和非特异性凝集反应的最有效方法，但对因存在抗原交叉（如耶尔森菌 O:9）细菌感染产生的非特异性凝集反应无效。

为了区分特异性凝集和非特异性凝集，Rose 和 Roepke 在 1957 年报道了一种经过改进的RBT。他们发现，在检测前将所用的抗原缓冲液处 于 pH4.0 条件下，可抑制牛种布鲁氏菌抗原与牛血清的非特异性反应，而血清中的布鲁氏菌抗体活性却基本不受影响。向 清中加入弱酸，使血清 pH在 3.7~4.1 范围内，可最大程度消除非特异性凝集；pH 在 3.8~4.2 范围内，牛血清的缓冲能力最强。乳 酸和醋酸对酸化牛血清最有效。由于直接酸化给清不方便操作，改为酸化 RBT 抗原，当抗原与给清混合时，血清得到酸化，从而达到抑制非特异性凝集反应的目的。RBT 抗原经过酸化处理，可有效消除凝集反应中的“前带现象”，这是由于存在非布鲁氏菌抗体 IgM，从而使产生的非特异性反应大大降低。尽管在 pH3.8~4.2 范围内，酸化抗原可以极大减少非特异性凝集反应，但该条件下抗原 不稳定，为此 1965 年美国农业部（USDA）国家动物疫病实验室对酸性平板凝集试验进行修改，采用虎红染料对牛种布鲁氏菌悬液染色，并将缓冲液pH 调整为 3.65。该试验方法在美国称为卡片试验（card test），而在其他国家，如法国、英国等，称为虎红平板试验（RBPT），后来简称 RBT。研究发现，在 pH3.65 条件下，IgG1 的非凝集特性转变为能凝集布鲁氏菌。IgG1 凝集能力改变的原理并不清楚，推测可能是在酸性条件下，打开 了 IgG1 的铰链区，使抗体分子变为二价，使其具有凝集布鲁氏菌的能力；诊断实验室在持续检测中发现，在 pH3.65 条件下开展 RBT 检测，血清中存在的阻断凝集效应和相关的“前带现象”也消失了。

3.2 RBT 抗原需经标准化 

制备 RBT 抗原所用的菌株、培养菌的批次， 特别是抗原浓度，能对RBT性能（敏感性和特异性）造成很大影响。为使 RBT 性能保持一致，需用参 考 清对不同菌株和批次的RBT抗原进行标准化， 这是非常重要的。世界动物卫生组织（WOAH） 的参考给清被认定为国际标准血清，是所有其他标准血清（如国家标准血清、工作标准血清）进行校准的依据。用国家标准血清对 RBT 抗原进行标准 化，可使不同厂家制备的 RBT 抗原达到统一标准，使检测结果在国内具有一致性。但需要注意的是，抗原标准化并不一定意味着 RBT 具有最佳的诊断敏感性（DSe）和诊断特异性（DSp），还需用血清盘进行验证，以获得最佳检测性能。

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