第十届李曼中国养猪大会听课笔记（9）

（一）引言：非洲猪瘟养猪人面前的两条路：带毒生产VS净化生产。未来还是走净化生产的路。

（二）传染性疾病的临床类型：最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、无症状感染型

（三）防控难度：最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、无症状感染型

（四）无症状感染的应对策略——三步法：

1. 发现异常个体：培训一线员工识别异常个体，倒地不起、精神倦怠、相拥而卧、四肢颤抖、减料、呕吐、腹泻、流产、出血……

2. 封闭单元格：垂直通风，解封时间需经过３个潜伏期；

3. 单元格内覆盖性检测：①检测样品：异常个体、关联个体和环境。②覆盖性检测技巧。

样本预处理：预处理液1:1，离心（1.2x104RPM）取上清；

核酸提取与纯化：过膜提取、手动或自动磁珠提取；

实施高循环：采取五十个以上的高循环；

判断标准：起跳即阳。

六、湖南农业大学葛猛：定量PCR在猪病防控中的应用及常见问题

（一）什么是定量PCR

定量PCR，又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法技术，有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。

（二）定量PCR在猪传染病防控中的应用

1. 传染病诊断的方式之一；

2. 病原体的检测；

3. 疫病的净化：非瘟精准剔除（拔牙）、蓝耳净化；

4. 疫苗的检测；①弱毒疫苗的效价检验；②疫苗中是否有其他病原的污染。

5. 疫苗免疫效果的评估：①免疫之后是否仍然感染？②免疫之后的感染量。

（三）定量PCR应用存在的问题

1. 检测的时间“窗口”问题

2. 试剂的敏感性评估的问题：①分析敏感性（灵敏度检测）；②诊断敏感性的分析：重点在于不同毒株及弱阳性样品的检出率。

3. “假阳性”和“翘尾”问题：① 造成的原因：低浓度样品的检测结果不稳定（泊松分布）；低水平的核酸污染（阳性对照、阳性核酸样品、PCR产物的气溶胶）；扩增试剂的特异性（非特异性扩增、探针裂解）；定量PCR仪或耗材等其他因素。② 出现这种情况该怎么办？

a.实验室处置：继续用现有试剂盒再次检测，并增加重复数；换试剂盒再次检测（要换灵敏度更高的试剂盒，同时增加重复数）；排查是否存在低水平的核酸污染，并且用巴氏消毒。

b.现场处置：对于来源于主场外围的样品，直接继续消毒、隔离、再检测；对于主场内部样品，局部加大排查和监测力度。

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