动物源性食品中细菌的检测——副溶血性弧菌

5.2 分子生物学方法

5.2.1 DNA模板的制备

取以上增菌液1mL于小离心管中，4000～5000r/min离心5min，弃上清液，向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清液作为PCR模板。

5.2.2 引物设计

上游引物为5′-AAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3′；下游引物为5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′。扩增片段长度为450bp。

5.2.3 PCR反应体系

25μL反应体系：DNA模板2.0μL；PCR预混液12.5μL；引物10L；ddH2O9.5μL。

5.2.4 PCR反应参数

95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min。4℃保存。

注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。

5.2.5 电泳

用电泳缓冲液（1×TAE）制备1.8%～2.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。

5.2.6 结果判定

在阴性对照未出现条带、阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如检测样品未出现450bp大小的扩增带，则判为阴性；如检测样品出现450bp大小的扩增带，则判为阳性。

如果阴性对照和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，则本次检测结果无效，应重新试验。

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