时间：2021-08-13 点击： 次 来源：中国兽医发布 作者：曲志娜 赵思俊等 - 小 + 大
| Friedli建立了质谱法测定AF，其中AFM1的检出限为100pg，并提出对试样进行简单的净化，如蒸干后再溶于甲醇-水（1:2）溶液中，可去除其他污染物的干扰。William等建立了两种质谱法分析农产品和生物体液中的AF，一是经薄层色谱法等净化过程的电子电离（electron ionization，EI）质谱分析，检出限为10～50ng/kg；二是高分辨选择离子监测（high resolution selected ion monitoring，HRSIM），可直接进行混合组分的分析，且较EI法灵敏度提高100倍以上。 朱聪英等则直接应用LC-MS法测定了饲料中6种AF（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）的含量。试样中的AF经84%乙腈溶液超声提取后，用正己烷脱脂，过霉菌毒素多功能固相萃取柱净化，氮气吹至干，用流动相溶解后进行LC-MS/MS测定。方法的最低检出限为0.2μg/kg，定量限均为0.5μg/kg；标准工作液在0.5～100μg/L的范围内线性良好；加标浓度在1.0～100μg/kg，饲料中AF的回收率在66.1%～108%，批内RSD为17.8%，能满足相关法规要求。 5.4 免疫分析法 免疫化学法是根据免疫学抗原抗体高特异性结合原理，设计并发展起来的免疫学检测技术。该方法具有重现性好、灵敏度高、选择性强、特异性强、时间短、检测限低等特点，同时又能减少有害试剂的使用，对检测人员的健康起一定保护作用，在AF检测方面取得了很大的应用。具有代表性的主要有免疫层析法（ICA）、放射免疫法（RIA）、ELISA、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等，它们均可以进行定量测定。其中由于放射免疫法需要特殊设备和安全保护，其应用受到了极大限制；免疫层析柱、胶体金试纸条及ELISA检测试剂盒是目前应用较为广泛的AF快速检测产品；TRFIA在AF检测方面尚属新技术，但TRFIA检测的高灵敏性使其在该领域的发展具备很大的潜力。 AF均属于小分子半抗原，需要与大分子载体蛋白偶联才能作为免疫原或检测抗原诱导AF特异性抗体的产生。目前AFB1人工抗原的制备方法为碳二亚胺法，该方法分为两种，一种是在有机相中进行反应的二环己基碳二亚胺法（DCC），另一种是在水相中进行反应的对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法（EDC）。DCC法需要在严格的无水条件下反应，所用的有机溶剂需预先脱水处理，且需要干燥的反应环境，较为繁琐；而EDC法可直接在水相中反应，操作简便。 EDC法制备AFB1人工抗原主要分为AFB1肟化物的制备和AFB1肟与BSA偶联两步反应。 ELISA是免疫分析法中最为常见的。ELISA检测AF的方法大体分为两类：一是用双抗体夹心ELISA法。将AFB1牛血清白蛋白涂于微滴定板池上，经初步培养后，加AFB1抗体和游离AFB1，用磷酸-4-硝基苯酯做基质，以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合；二是用竞争法检测样品中的AF。在涂抗体的小孔中，用乙烷萃取AFB1，并与结合了辣根过氧化酶的AFB1混合置室温下10min后，用水洗除未结合的AF共轭物，加底物后在405nm检测。 ELISA灵敏度高，比薄层色谱法的灵敏度可提高近200～500倍，特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰，而且回收率高、准确性好、提取方法简单，测定时间只需2h左右，可同时检测近百份样品，大大提高了检测效率。我国在20世纪90年代中期开始开展了用ELISA检测AFB1的应用研究，取得了很好的效果，显示出该方法简便易行、耗时少、特异性强、灵敏度高的特点，对于大量样品的筛选检测尤为适合。 路戈等用单克隆抗体ELISA与薄层色谱法（TLC）对比检测了粮油样品，TLC检测结果表明，在方法灵敏度下（5ng/g）所检样本中均无AFB1检出。而这些样品按ELISA检测，AFB1检出率为96%，含量在0.05～2.20ng/g。ELISA的检测灵敏度远高于TLC法。一般认为AFB1间接竞争抑制ELISA（IDC-ELISA）定量分析法比传统TLC更具有简便、经济的特点，它不仅适用于大批量样品的快速检测，而且具有投入商品化生产及“家用化验”发展的潜力。 刘冬儿用ELISA测定食品中的AFB1，线性范围0.25～5.0ng/mL，检测灵敏度达0.015μg/kg，比TLC提高300～400倍，回收率大于89.2%，精密度大于7.67%。整个测定过程为4h，在很大程度上缩短了检测时间。 |
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