时间：2021-08-10 点击： 次 来源：中国兽医发布 作者：曲志娜 赵思俊等 - 小 + 大
| 4.1.5 杆菌肽敏感试验 取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04U的杆菌肽纸片置于上述平板上，36℃培养18～24h，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。 4.2 分子生物学方法 挑取单个可疑菌落接种于Luria-Bertani（LB）肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜，取1.0mL菌悬液于1.5mL离心管中，用冷冻离心机12000r/min离心10min，弃去上清液，再加入1.0mL灭菌双蒸水，涡旋制成菌悬液，放入水浴锅中煮沸10min，3000r/min离心5min，以上清液为模板进行扩增。上游引物为：5′-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3′，下游引物为：5′-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3′。反应体系：10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）1μL，MgCl2溶液（25mmol/L）3μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板5μL，用ddH2O补至50μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸45s，共作用35个循环，72℃再延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在100V条件下进行电泳，得到扩增长度为197bp的扩增产物为链球菌阳性。 4.3 ELISA 4.3.1 包被 用0.05mol/LpH9.0碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL抗体，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min（以下简称洗涤）。 4.3.2 加样 加一定稀释的菌液0.1mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 4.3.3 加酶标抗体 于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1mL。37℃孵育0.5～1h，洗涤。 4.3.4 加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。 4.3.5 终止反应 于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。 4.3.6 结果判定 可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”“－”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍即为阳性。 |
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