动物源性食品中寄生虫的检测——旋毛虫

4 国内外卫生要求

欧盟2004/854/EC法规于2004年4月29日规定了对适于人类消费的动物源性产品官方控制组织的特定规则（第18条），确保每一个动物胴体都接受了宰后检验、企业按照欧盟要求进行了微生物检测、官方按照欧盟要求进行了旋毛虫检测、肉品加贴了正确的卫生标志。官方肉品检验员主要负责动物宰后检验，并按照国家残留监控计划进行样品取样，对出口的猪肉签发兽医卫生证书。

英国猪肉企业都建立并实施了HACCP法规，基本都按853/2004规章要求进行生产与卫生管理，确保动物健康与动物福利，官方部门按854/2004号规章进行卫生控制，按2075/2005号规章对肉中旋毛虫进行官方监控。

5 检测方法

5.1 病原学方法

寄生虫直接检查一般专指宰后胴体检查，但宰前活体检查法已有人报道过。直接检察法的敏感性与被检的组织量和采集组织的位置有关。通常采用的方法是旋毛虫镜检技术，其敏感性为每克组织3个蚴虫，而混合样品消化法的敏感性为每克组织1个蚴虫。直接检察法能直接鉴定出感染后17d的猪，这与肌肉内的包囊蚴已对新宿主具有侵染力的时间是一致的，只要包裹蚴是活的，那么直接检察法就长期有效。在有大量组织（100g）可供消化情况下，本法的敏感性就大为提高。直接检查法，特别是旋毛虫检查法的缺点是耗时、费力、开支大。肌肉活组织检查感染后第4周取三角肌或腓肠肌（或浮肿、肌痛最显著的部位）近肌腱处肌肉一小块，置两块玻片中压紧，低倍镜下观察，可见卷曲的幼虫，虫体周围有多数炎性细胞包绕，形成小型肉芽肿。感染较轻镜检阴性者，可将肌片用胃蛋白酶和稀盐酸消化，离心沉淀后检查幼虫，其阳性率较压片法为高。旋毛虫病的直接检察常用的是下面两种方法：

5.1.1 旋毛虫镜检或组织压片法

取膈肌作为检查样品，将其切成至少28块，每块大小约为2mm×10mm。也可以取其他部位的样品，如舌、咬肌及腹肌。但为了做敏感性比较，应采用较大的样品。将组织块放在两块玻片之间，用力挤压成半透明状。然后，通过一台特别的投射显微镜即旋毛虫镜或者一台15～40倍的常规显微镜做虫体检查。在单个肌细胞上可见卷缩的幼虫。由于幼虫有囊，肌细胞的形状为卵圆形。在严重感染时在单个肌细胞上可见多个幼虫。这种方法很难测出在肌细胞中不存在的拟气门旋毛虫幼虫。

5.1.2 消化法

肌肉组织可用消化液消化，这样能使肌囊释放出活的旋毛虫。这里介绍的是欧盟（Eu）内部常用的四种消化方式：①人工消化单个样品或混合样品；②机械混合样品消化沉降技术；③用滤器分离技术的机械性混合样品消化法；④混合样品磁力搅拌法。具体操作如下：

（1）采样 一般从动物的膈肌处或舌部取肌样，马从舌肌或咬肌处取样。其他部位的器官组织存在包囊蚴数目一般较少。样品块大小可以不同，但从一头猪猪体上采取100g样品，或从许多头猪猪体上采取许多样品，混在一起为100g。样品的大小将决定后一种方法的敏感性。欧盟要求在检查猪胴体时每100g产品中取1g样品，检查马肉时每100g产品中取5g样品。在美国，猪要求取5g样品。实际操作中，样品最小5g，即100g混合样品中含20个动物的样品，样品磨碎或切碎以便消化。

（2）消化和回收 每100g组织样品用1L人工胃液，内含1％（w/v）胃蛋白酶（1/10000中国药典）和1％（V/V）的盐酸（0.12N终浓度）消化。将磨好或切好的组织样品加入已预热至37℃的消化液内，然后放到磁力搅拌器上，在37℃搅动3h，或在较高温度下可缩短搅动时间（如44～46℃30～60min）。静置15～20min让消化物澄清，将上部2/3的液体倾去，将余下的液体和沉渣再通过网眼直径为355μm的玻璃漏斗筛滤后，静置15～20min。将上部上清液尽可能吸去，但不要泛起沉渣。沉淀用温热（37℃）的自来水冲洗，再静置15～20min。反复冲洗直至上清液透亮。将洗过的沉淀物移入50mL的试管内，让其静置，吸取最下面的10mL沉淀。为了计数，则把所有的10mL沉淀倒进一个有适当坐标方格的培养平皿内，并用解剖显微镜（15～40倍）检查旋毛虫幼虫。一期幼虫被消化后脱离肌细胞，大小约1mm长、0.03mm宽。旋毛虫幼虫的主要特征是食管部含有圆盘形的一系列细胞，这一部分占身体的半数以上。旋毛虫幼虫天冷时呈卷曲状，热时运动，若死亡则呈C形。若有可疑则应用高倍镜或取更多的组织检查。如果数目较大，则应做适当稀释。在混合样品消化物中检出包囊蚴时，则必须用组成混合样品的单个样品重复上述检查。

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