动物源性食品中细菌的检测——李斯特氏菌

硝酸盐还原试验：只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸盐，可以此区分格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用胰蛋白胨大豆胨肉汤培养物接种到硝酸盐肉汤中，35℃培养5d，加入0.2mL试剂A（磺胺酸冰醋酸溶液，将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中），再加入0.2mL试剂B（α-萘胺乙醇溶液，将α-萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中），混匀，如出现紫红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1h，如出现红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。

动力试验：将胰蛋白胨大豆胨肉汤培养物接种到SIM（硫化物、吲哚、动力）培养基或改良塞耶-马丁（MTM）培养基，室温培养7d，逐日观察，李斯特氏菌有动力，呈伞状生长。在MTM培养基上形状尤为突出，可以明显观察到伞形。另外，通过相差显微镜，可观察30℃胰蛋白胨大豆胨培养基上的培养物的翻滚运动。

糖发酵试验：将胰蛋白胨大豆胨琼脂平板上培养物接种于含以下0.5%糖的紫色肉汤中（可加入小倒管）：葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培养7d。阳性反应是产酸，不产气。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖都是阳性反应。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外，其余的李斯特氏菌对甘露醇呈阴性反应。若不同选择性培养基上的纯化物着色是确定的，则七叶苷发酵试验可省略。

（6）小鼠毒力试验检测李斯特氏菌致病性的传统试验是Anton相交试验，既小鼠注射试验和鸡胚注射试验。小鼠抵抗力测定试验是将细菌从腹腔注入，该实验有很高的敏感性，可了解单核细胞增生李斯特氏菌对动物的致病性。

将4mgCarageenan（sigma typeⅡ）溶解在蒸馏水中，注射到18～20g体重的小鼠体内，24h后，李斯特氏菌开始表现毒性。小鼠体内的Carageenan（sigma type II）注射量应依据小鼠的体积而定，一般注射量为每1kg体重注射200mg。分离物在胰蛋白胨大豆胨中35℃培养24h后，再转移到两个管中，35℃培养24h，然后再将10mL的肉汤培养物转移到离心管中，1600r/min离心30min，弃上清液，用1mL灭菌生理盐水制成菌悬液，此时菌浓度为1×1010CFU/mL，稀释成1×105CFU/mL，将0.1mL菌悬液注射到16～18g体重的Swiss小鼠体内，约注入104个菌，观察5d内小鼠的死亡情况。非致病菌不会致小鼠死亡。用致病菌、非致病菌、Carageenan（sigma typeⅡ）处理的小鼠及未注射的小鼠做对照试验。每组试验用5只小鼠，Carageenan（sigma typeⅡ）处理的小鼠应该能够忍受0.1mL的PBS。

4.2 分子生物学鉴定

（1）DNA模板的制备取增菌液1mL于1.5mL离心管中，4000～5000r/min离心5min，弃上清液，向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清2μL作为PCR模板。

（2）引物设计

引物1：上游引物为5′-TATGTGCGATACCGCTTGAA-3′；下游引物为5′-GAAACTAACGGＧGATAAAACC-3′，扩增片段长度为511bp。

引物2：上游引物为5′-TTATGATGACGAAATGGCTTAC-3′；下游引物为5′-ATGGACGATＧGTGAAATGAGC-3′，扩增片段长度为789bp。

（3）PCR扩增 PCR反应体系25μL，具体成分见下表。

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