动物源性食品中细菌的检测——霍乱弧菌

      5.3 血清学鉴定

  5.3.1 血清学凝集试验

  从培养基上挑取可疑菌落与O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s内）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集，则判为O1群或O139群阳性。

  与O1群或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均不凝集，且生化反应符合霍乱弧菌特性的为非O1群霍乱弧菌。

  与O1群霍乱弧菌多价血清或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均凝集的，说明菌体有自凝现象，可用胰蛋白胨大豆琼脂或脑心浸液琼脂传代，再进行凝集试验。

  5.3.2 血清分型试验

  与O1群多价血清凝集的霍乱弧菌可进一步用小川型、稻叶型的单价抗血清分型：与小川型单价血清凝集，但与稻叶型单价血清不凝集者为小川型；与小川型单价血清不凝集，但与稻叶型单价血清凝集者为稻叶型；与小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。

  5.3.3 试管凝集试验

  对玻片凝集反应不典型的菌株应做试管凝集试验。用生理盐水1∶20开始倍比稀释O1群霍乱弧菌多价血清，每管含稀释血清0.5mL。将被检菌在营养琼脂的16～18h培养物用0.2%甲醛生理盐水制成每毫升约含1.8×109CFU（相当于细菌标准比浊管浓度）的菌悬液，每稀释血清管加入0.5mL；另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水作为对照。摇匀，置（37±1）℃培养3h观察初步结果。再放于4℃或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使试验菌凝于管底呈伞状，上清液半透明者判为＋＋；能使试验菌出现＋＋凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度。凝集滴度达到或超过血清原效价一半即确定为O1群霍乱弧菌。

  5.4 分子生物学鉴定

  5.4.1 制备DNA模板

  取以上碱性蛋白胨增菌液1mL加到1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，弃上清液，用1mL双蒸水或pH7.4的PBS洗一遍，8000r/min离心5min，尽量吸干上清液；在沉淀物中加入100μL超纯水，振荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，上清液即为扩增模板。将上清液转移至新的离心管中，并保存在－20℃备用。

  5.4.2 引物

  根据霍乱弧菌特有的靶序列设计一对特异性引物。扩增片段长度为588bp。引物序列：5′-CACCAAGAAGGTGACTTTATTGTG-3′；5′-GAACTTATAACCACCCGCG-3′。

  5.4.3 PCR反应体系

  25μL反应体系：DNA模板2.0μL；PCR预混液1.25μL；引物1.0μL；ddH2O加至25μL。

  5.4.4 PCR反应参数

  95℃预变性5min；95℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸120s，30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存。

  5.4.5 电泳

  用电泳缓冲液（1×TAE）制备2.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。

  5.4.6 结果判定

  在阴性对照未出现条带、阳性对照出现所有预期大小的扩增条带条件下，如检测样品未出现588bp大小的扩增条带，则可判定该样品检验结果为阴性；如检测样品出现588bp大小扩增条带，则可判定该样品结果为阳性。