动物源性食品中细菌的检测——肉毒梭菌

（4）培养特性检查 挑取可疑菌落接种于2份卵黄琼脂平板，分别于厌氧或需氧条件下培养48h，观察。如需氧条件下无细菌生长，而厌氧条件下有细菌生长，并有虹彩样薄层，证明有肉毒梭菌存在。

4.2 肉毒毒素检测

液体样品可直接离心，固体或半固体样品需加适量明胶缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测；另取1份上清液，调pH至6.2，按1/10的量加10%胰酶（活力1:250）水溶液，混匀，不断轻轻搅动，37℃作用60min进行检测。肉毒毒素检测以小鼠腹腔注射法为标准方法。

（1）检出试验 取离心上清液及其胰酶激活处理液分别腹腔注射3只小鼠，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有毒素，小鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为立毛、四肢瘫软，呼吸困难，呈风箱式呼吸，腰部凹陷，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以致临床症状不明显，则可将注射液做适当稀释，重做试验。

（2）中和试验 分3组进行，各取1mL被检毒素液，第1组（毒素中和组），加等量多型混合肉毒抗毒素，混合后置37℃作用30min；第2组（毒素灭活对照组），加等量缓冲液，混匀后煮沸10min；第3组（毒素对照组）加等量缓冲液即可。3组混合液分别腹腔注射小鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。若第1组和第2组小鼠均获保护存活，而第3组小鼠以特有症状死亡，则可判定为肉毒毒素存在；若第1组也不存在，则说明该毒素不是肉毒毒素，必要时需进行毒素定型试验。

（3）毒力测定 取已判定含有肉毒毒素的检样离心，取上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。根据小鼠死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大致毒力（MLD/mL或MLD/g）。例如5倍、50倍及500倍稀释致小鼠全部死亡，而注射5000倍稀释液的小鼠全部存活，则可大致判定检样上清液所含毒素的毒力为1000～10000MLD/mL。

（4）定型试验 按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大致在10～1000MLD/mL，分别与各型肉毒毒素诊断血清等量混合，置37℃作用30min，各注射2只小鼠，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护小鼠免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。

注：①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验。②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的各项试验也可同时进行。③根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型。④进行确证及定型试验时，检样稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。⑤试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。

4.3 分子生物学方法

4.3.1 肉毒梭菌的PCR检测方法

PCR技术灵敏度高，在有大量杂菌存在时也不产生干扰。但该法检测的是肉毒梭菌菌体内的毒素编码DNA，并不能测定污染样品中是否含有毒素蛋白，只鉴定出食物有肉毒梭菌污染，并不能说明食物中毒的原因就是肉毒毒素。

（1）分离纯培养物 按前述方法进行增菌培养，然后取1～2mL培养液置于螺旋帽试管中，加入等量过滤除菌的无水乙醇，混匀，在室温下放置1h；或80℃加热10～15min，以破坏其繁殖体。

用接种环取1～2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置（35±1）℃厌氧条件下培养48h。挑取约10个单个的典型菌落。接种可疑菌落到TPGY培养基中，置（35±1）℃厌氧条件下培养24h。

（2）模板DNA的制备 以下两种方法任选一种。

热裂解抽提DNA法：取1.4mL TPGY培养物转移至15mL离心管中，14000g离心2min，弃去上清液。加入1.0mLPBS悬浮菌体沉淀，14000g离心2min，弃去上清液。用400μLPBS重悬沉淀，加入10mg/mL溶菌酶溶液100μL，（37±1）℃水浴15min，期间每5～7min颠倒混匀离心管。加入10mg/mL蛋白酶K溶液10μL，（60±1）℃水浴1h，期间每10～15min颠倒混匀离心管。沸水浴10min，14000g离心2min，将上清液转移至新的灭菌1.5mL离心管中。加入3mol/L乙酸钠（NaAc）溶液50μL和95%乙醇1.0mL，颠倒混匀，－70℃或－20℃放置30min，14000g离心10min，弃去上清液，沉淀干燥后溶于200μLTE（TrisＧEDTA）缓冲溶液。测定纯度和浓度后置于－20℃保存。

首页前一页1234后一页尾页