动物源性食品中细菌的检测——肉毒梭菌

肉毒梭菌中毒在畜禽中的发生与饲料保存和处理、放牧地的卫生条件有密切关系。在畜禽中以鸭、鸡、牛、马较为多见，绵羊及山羊次之，猪、犬及猫少见。易感畜禽为单蹄动物、家禽、大小反刍动物及猪。貂也有很高的易感性。自然发病主要是由于采食腐败尸体、腐败饲料所引起。

人的肉毒梭菌中毒发生并不多，但是发病急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潜伏期较短，一般为6～36h，最长60h。主要症状有：视力减弱、全身无力、伸舌和张口困难、抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。

肉毒梭菌中毒一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有着密切关系。引起人类中毒的食品有腊肠、火腿、鱼和鱼制品及罐头食品等。在美国以罐头食品中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要与发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等。其他引起中毒的食品还有熏制未去内脏的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。

3 危害

肉毒梭菌是严重的食源性致病菌，是致死性最高的病原体之一。肉毒梭菌感染剂量极低，每个人都易感。摄食18～36h后发病为典型病症，但不典型的可在4h至8d不等。症状为虚弱、眩晕、复视、渐进性说话障碍、呼吸和吞咽困难，也会出现腹胀和便秘。

肉毒毒素是一类锌结合蛋白，具有蛋白酶活性，性质稳定，毒性极强，是最强的神经麻痹毒素之一，也能损害血管细胞和其他组织。当摄入的毒素经胃肠吸收进入血液后，即对外周神经系统和自主神经系统发挥作用，毒素由于抑制了前突触点（pre-synaptic sites）的乙酰胆碱的合成与释放，阻滞了神经冲动的传导。毒素在起始阶段损害延髓的运动中枢，以后随着疾病的发展而损害外周肌肉纤维，阻滞神经肌肉接头突触中的神经细胞释放乙酰胆碱而导致肌肉麻痹。

毒素作用是目前已知的化学毒物、生物毒素中最为强烈的，比氰化钾的毒性还强1万倍。毒素在消化道内不被破坏。液体中的毒素在100℃经15～20min才可被破坏，在固体食物中则经2h才可被破坏。精制毒素1μg的毒力为200000只小白鼠（20g/只）致死量，也就是说，1g毒素能杀死400万t小白鼠，一个人的致死量大概1μg。1899年至1990年，在美国共有2305人中毒，经检测，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人感染E型毒素，2人感染F型毒素，有两起中毒事件是由A、B两种毒素引起。F、G两种毒素主要引起动物肉毒中毒，尚未得到深入研究。

4 检测方法

肉毒毒素中毒的实验室诊断，国内主要以国标GB478912—2016为标准。从病人的血清、粪便、胃肠内容物、呕吐物及可疑食品等样品中检测到肉毒毒素是最可靠的诊断依据。可见，检出污染物中存在肉毒毒素并鉴定出毒素型别是确定肉毒中毒的关键。但在一些婴儿肉毒中毒病例中，只在粪便或胃肠内容物中发现肉毒梭菌对于肉毒中毒的确诊已足够，即使在样品中检测不到肉毒毒素。

4.1 分离鉴定

肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、鉴定即可。

（1）样品前处理 无菌称取25g样品，移入灭菌的均质器中，加入225mL明胶磷酸盐缓冲液，均质成匀浆。

（2）预增菌 将样品分别接种于疱肉培养基、胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGY）培养基，并分别于35℃、26℃培养7d。

（3）分离培养 培养7d后，染色、镜检，观察菌的形态是否为典型的肉毒梭菌。如有细菌生长，离心、取上清液接种于血平板和乳糖牛奶卵黄琼脂平板，于35℃厌氧培养48h后涂片，显微镜观察。

典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黄培养基上用斜光照射检验时菌落表面通常出现虹晕色，此光区称为“珍珠层”（G型无此特性），C、D、E型菌通常有2～4mm黄色沉淀区围绕，A、B型菌通常显示较小的沉淀区。

挑取典型菌落，分别接种于疱肉培养基、TPGY培养基，并分别于35℃、26℃培养7d，再取培养物进行培养特性检查或肉毒毒素检测即可。

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