猪场传染病的早期预警与清除技术（图）

操作要求：保持棉签及采样管干燥。

优点：样本无需做保护处理，自然条件下可保持较长时间。

b) 湿润表面湿法采样：预先在灭菌的旋盖采样管内加入0.5-1mL样本保护液，在采样现场使用干燥的灭菌医用棉签轻轻触碰采样点，并重复进行“Z”字形擦拭，棉签充分粘上采样点的表面物质之后，将棉签放进采样管内，做好标记。

操作要求：采样管内加入样本保护液。

优点：样本受到保护，可以常温保存及运输。

c) 液体湿法采样：预先在灭菌的旋盖采样管内加入0.5-1mL样本保护液，在采样现场使用干燥的灭菌医用棉签轻轻搅动待采液体，棉签充分粘上液体之后，将棉签放进采样管内，做好标记。

操作要求：采样管内加入样本保护液。

优点：样本受到保护，可以常温保存及运输。‍

1.4 检测方法

1.4.1 核酸检测

环境与唾液样本中病毒载量少、干扰物质多，尤其是唾液中还含有多种消化酶、抗体和其他生物活性物质，导致在风险监测过程中，对唾液核酸提取和检测的要求较高。如果检测环节过多或方法不当，PCR极易出现假阴性或阴阳不定的结果，会极大地增加生产中的风险。假阴性的危害不仅是让养猪场损失高昂的检测费用，更严重是引起管理者的误判。如果猪群存在无症状感染的阳性猪而没有及时清除，则很可能会让病毒悄无声息地传遍整个猪群，等到有猪只发病时再处理可能就损失惨重了。

要准确开展PCR检测核酸，样本的核酸提取是重中之重的工作。目前市场上有两种核酸提取方式：柱提法与磁珠法。柱提法的原理是：利用硅胶膜制成过滤柱，在不同的盐浓度和PH条件下，经过3-4次清洗和过滤，将核酸提取出来供给后续的PCR操作。近年来美国科学家创新性地制造出一种纳米级的磁珠微粒，并在它表面包裹一层二氧化硅基团（SiO2），使之在不同条件下吸附并提取核酸。

柱提法耗时较长，提取一次核酸一般需要17-35分钟不等；柱提法过滤柱的硅胶膜表面积大，对核酸的损耗较大，而且需要更换多个离心管，对环境相对不友好。相比而言，由于磁珠体积较小，磁珠法从原理上就决定了对样本核酸的损耗较少，而且它耗时短，有的产品只需要2分钟即可完成核酸提取；磁珠法所有操作只需在同一个离心管中进行，还可以使用自动化机器大批量操作，更加高效环保。更重要的是，磁珠最后可以与核酸一同进入PCR扩增环节，可以大幅减少假阴性出现的概率，这对于检测技术是一项史诗级的改变。它的缺点也十分巨大：磁珠是新兴事物，制作工艺复杂，产品以进口为主，国内生产厂家较少，进口依赖较大。

a) 核酸提取：建议采用磁珠法，市场上有多种产品，成本相近的情况下，2-9分钟即可完成核酸提取；还可以使用机器批量操作，10分钟可以提取几十份核酸，效率与准确性均远超柱提法。

b )核酸检测：市场上所有核酸PCR检测试剂盒的原理都相同，不同的是各自的引物、探针、反应体系的设计存在差异，导致各厂家产品准确性和稳定性有差异。猪场的实验室最好根据自己的需求，选择几个产品对比验证后，选择适合自身的产品。

表1 研究发现唾液中比血液中更早发现病毒核酸

1.4.2抗体检测

一般认为如果没有接种疫苗，检出抗体即表明当前或过去存在感染。对于急性疾病的爆发，只有核酸检测有意义，因为大多数猪在产生抗体前已经死亡；但是如果存在幸存的猪只，特别是ASFV转变为中等毒力或者弱毒力毒株之后，则可以通过抗体检测研究猪的免疫反应。

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