猪瘟诊断技术的应用进展

时间：2010-03-23 点击：次来源：何玲，黄文科，裴仉福作者：阳光畜牧网 - 小 + 大

    猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，影响了养猪业的发展。牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)同属于瘟病毒属，且与CSFV存在血清学交*反应，对猪瘟的诊断造成了干扰。此外，猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的大规模应用，也给CSFV野毒感染猪和疫苗感染猪的鉴别诊断带来较大困难。目前我国对猪瘟的诊断方法有多种，包括病毒病原检测、抗体检测和分子生物学检测三大类。本文简要介绍了几种猪瘟病毒诊断技术。
    一、病原学检测
    （一）病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定是诊断病毒性疾病最为经典和可靠的方法。取病变组织（扁桃体、脾脏、淋巴结等）研磨成乳液，离心、过滤后，接种于PK-15或猪睾丸细胞培养，CSFV不产生细胞病变效应(CPE)，接毒48～72 h后，用冷丙酮固定，进行免疫荧光或免疫酶染色，镜检。也可将病毒回归到健康动物体内，出现猪瘟的典型症状即可确诊。
    （二）猪瘟兔体免疫交互试验猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，猪瘟兔化弱毒(HCLV)能使家兔产生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则不产生体温反应。利用这一原理，将病料无菌处理后接种健康家兔，同时设注射生理盐水对照组。7 d后用HCLV静脉注射，每6 h测温1次，连续3 d。若对照兔发生定型热反应，说明试验成立，可分析判定结果；若试验组体温反应正常，则说明含有猪瘟病毒；若体温反应成定型热，则说明不含有猪瘟病毒。
    （三）免疫荧光抗体试验(FA) 直接荧光抗体试验作为猪瘟的法定诊断方法在许多国家和地区均已实行。采取CSF的病料或组织培养物，制备冰冻切片或触片，丙酮固定后用猪瘟荧光抗体染色检查，出现绿色荧光为阳性，否则为阴性。何若钢等利用荧光抗体技术对广西十几个猪场进行猪瘟调查，结果猪瘟阳性率达7.21%，而这些猪均外表健康无任何病症。荧光抗体检测法准确可靠、灵敏度高、特异性强。
    （四）鸡新城疫病毒强化试验(END) 猪瘟病毒与NDV在猪睾丸细胞上均不产生CPE。在一定条件下，先被CSFV感染的猪睾丸细胞，随后再感染NDV时可产生CPE。这一现象称为新城疫病毒强化试验(END)。具体方法是在猪睾丸细胞培养物中接种无菌处理的被检材料，37℃培养4 d，随后接种106个蚀斑形成单位的NDV，继续培养3 d。如果细胞出现病变，则表示有CSFV存在。此强化现象可被CSFV的抗血清所抑制，可用于CSFV的中和试验。
    二、血清学检测
    血清学检测通常用于了解猪的群体免疫水平和对疫苗免疫效果进行评价，为预防接种提供科学依据。
    （一）猪瘟正向间接血凝试验（IHA ）抗原与相应的抗体在一定条件下结合形成抗原抗体复合物，但一般肉眼看不见这种复合物。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，就能大大提高抗原抗体反应的灵敏性。李树春等用浓缩的HCLV致敏由戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，当其与相应抗体相遇时，红细胞便出现清晰可见的凝集现象，这就是IHA的原理。本实验室曾用猪瘟IHA试剂盒来检测猪的群体免疫水平，该方法操作简单、重复性好。
    （二）中和试验病毒或毒素与相应的血清抗体结合后，失去了对易感动物或敏感细胞的致病力，这是中和试验的基本原理。
    1.兔体中和试验。将HCLV与系列稀释的待检血清中和，接种家兔观察体温变化，以此确定血清的终点滴度。当稀释度大于1:32时，则表明待检血清能够保护猪群免受CSFV感染；当稀释度小于1:32时，应及时对猪群进行免疫接种。
    2.荧光抗体病毒中和试验。将待检血清56℃30 min灭活后做适当稀释，与等体积的200 TCID50/0.1 ml的CSFV中和，然后接入PK-15细胞，维持液孵育2 d以上。采用直接免疫荧光方法进行检查，并设立对照组。可发现对照组有翠绿色光斑，而试验组光斑消失。
    3.过氧化物酶联中和试验。将待检血清稀释后与200 TCID50/50μl的病毒液中和，然后接入细胞，待细胞长成单层后固定，加入高免猪抗CSFV血清，最后加入辣根过氧化物酶(HRPO)标记的抗猪IgG，作用后加入底物显色，根据颜色就可判定结果。
    （三）间接ELISA试验间接ELISA法首先包被抗原，将待检血清稀释后加入孔中，然后加入HRPO标记的葡萄球菌蛋白A或其他可与抗体结合的物质，作用后加入底物显色，酶标仪读数判定结果。根据包被抗原（猪瘟强毒或HCLV）的差异，可用来检测抗猪瘟弱毒或强毒抗体水平。检测猪瘟弱毒抗体效价水平，以此判断免疫接种是否成功及保护率高低，从而确定免疫程序，及时淘汰免疫耐受猪（疫苗接种后不产生或仅产生低水平抗体的猪）；检测猪瘟强毒抗体，可及时淘汰猪群中的隐性带毒者。

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