牛结节性皮肤病检测诊断技术

4、检测诊断标准

4.1 检测诊断标准

表1  检测诊断标准

4.2 实验室检测方法

4.2.1 电镜观察法

取新鲜的皮肤结节，制备组织悬液，用投射电镜观察。山羊痘病毒粒子如砖状，周围覆盖有短管状结构，大小约为（290×270）nm，有些病毒粒子周围有宿主细胞膜包围。实际上，山羊痘病毒很难与正痘病毒区别，且其形态学上与牛痘和痘病毒没有区别，但牛很少发生痘病毒和牛痘病毒感染，也不引起全身性感染，其他正痘病毒则均不引起牛发病。而副痘病毒在电镜下其形态小于痘病毒，呈卵圆形，外面有单个连续管状结构，像沟槽覆盖在病毒粒子周围，能与牛型山羊痘病毒区分开来。

4.2.2 病原学检测

进行病毒分离，可采集血液或组织。采集出现全身病灶4 d内牛的抗凝血，离心取上清液中含病毒的血沉棕黄层；或采集出现临床症状一周内的皮肤结节、肺病灶、淋巴结及病灶周围组织，制成匀浆液，分别接种于羔羊睾丸细胞（LT细胞）培养。连续14 d观察细胞病变（CPE）。CPE特征是细胞膜皱缩到细胞圆缩，核染色体边缘化。最初看到小面积的CPE，4～6 d波及整个细胞层。14 d后如未发现CPE，培养物应该冻融3次，取上清液接种新鲜的LT细胞并做二次培养。如出现CPE征兆，则进行特异性鉴定。即取培养物用丙酮进行固定，HE染色。由于山羊痘病毒在细胞内产生特异性的CPE和胞浆内包涵体，所以当看到相当于细胞核的一半、大小不一、且周边有清晰晕的呈亮红色嗜酸性细胞浆内包涵体，即可诊断为痘病毒感染。

4.2.3 血清学检测

采集患牛血液制备血清，以LSD阳性血清和阴性血清作对照，进行血清中和实验。中和滴度大于等于1:5为阳性，小于1:5为阴性，具体操作可参照SN/T 2515-2010 牛结节疹检疫技术规范。

4.2.4 聚合酶链反应

聚合酶链反应（PCR）是一种快速、灵敏的检测血液、皮肤和精液中病毒DNA的方法。LSD的荧光定量PCR检测方法。以LSDV国际标准毒株基因序列，设计特异性引物，F：5’-TTGTCAGAAACGAGG-3’，R：5’-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3’和一条 MGB 探针[（FAM）5’-TCTTGCTAAAATACCA-3’（MGB）]。取皮肤、肺、脾脏、淋巴结或肌肉等组织样品，或血液进行核酸提取。以牛结节皮肤病病毒DNA做阳性对照，以不含LSDV的牛肉组织或原代睾丸细胞DNA做阴性对照，以水作空白对照，进行荧光定量PCR反应。

结果判定：Ct 值小于等于35，而且出现明显的扩增曲线，判定样品中存在LSDV核酸，无特异性扩增曲线或Ct值大于40，判定样品中无LSDV核酸，而35.0＜Ct值≤40.0的样本重做，重做结果无Ct值且无明显扩增曲线则为阴性，而有Ct 值且有明显扩增曲线则为阳性。

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