由新冠病毒核酸检测引发的兽医实验室核酸检测的思考

由此可见，兽医临床上我们要对患病动物的典型部位进行采样，或者同一患畜多部位采集且合并采集样本进行检测。在采样前对患病动物进行初步诊断，需选择病原体含量较高的部位进行采集，如呼吸道症状明显的采集鼻咽拭子、口咽拭子，然后放同一采集管中；如有消化道症状的同时采集粪便或肛拭子进行混合保存，然后取混合样进行检测。对确诊为细菌病的动物要注意其血液、尿液、脓汁、分泌物、粪便及肿胀局部组织的渗出液等材料的采集。对于病死畜，需要尽量在无菌条件下采集具有典型病变的器官和组织，以及病原含量较高的脏器或内容物，若需要做病理切片，采集的组织最好在病健结合部。在采集脏器时需注意，一定要保留其被膜或完整的结构，如肾脏要有髄质部等。此外，无论何种疫病病死畜，体内的淋巴结、心、肝、脾、肺、肾有无病变，通常都一并采集。

3、采集方法不规范

采集人员的操作规范程度同样影响样本的质量及检出率，比如新冠肺炎疑似病例患者鼻咽拭子采样时，要求“三个要”，即要深、要转、要取细胞。“要深”即距离从耳垂到鼻尖长度的一半，“要转”即转动10~15s，转动4~5圈，“要取细胞”即取到鼻咽部的细胞，否则无法保证样本的质量。假如鼻咽拭子采样困难，可考虑口咽拭子采样，此时要注意用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁3~5次。然后将拭子头浸入含3ml病毒保存液管中，尾部折断弃去，立即旋紧管盖。

兽医临床检测时，除了一些拭子采样，我们还会有组织、血液、尿液等样品的采集。无论哪种采集方法和样品，都要规范性操作，需尽量保障无菌的条件，特别是用于微生物学的检查，须采集到含有病毒的细胞和含有细菌的组织等，而且病毒的含量要达到核酸的检测下限。采集后的患畜部位和采样用的器械及盛放容器需进行灭菌处理，避免样品被污染，确保核酸检测的准确性。

在规范采集方法和保证样品质量的前提下，还要做好个人的安全防护。因为采集的样品含有很多的不确定因素，我们尽量按照高一级级别的个人防护，确保个人的人身安全。采样时如果发现动物急性死亡，不要随意剖检，需进行血涂片的镜检，确定不是人畜共患的高致病微生物感染，如炭疽等，之后方可进行解剖采样。采样结束后还要对尸体、场地及采样人员进行严格的消毒处理，避免感染性物质的扩散。

4、样本的保存和运输方法不当

正确的保存样品，使病料新鲜或接近新鲜的状态，是保证检测结果准确性的前提条件。临床采集的样本会受环境因素、试剂、保存管等因素的影响，导致细胞破碎释放出内源性RNA酶，病毒RNA在空气中也很容易降解，从而影响我们最后的检出效率。原则上，样本采集后最好放在防病毒核酸降解的标本采集管中，且及时送到实验室，尽快完成检测。标本在室温下存放时间过长，容易引起核酸的降解，致使检测结果不能呈现阳性反应。因此，建议样本采集后室温存放不超过2~4h，2~8℃条件下不超过72h，如果不能及时检测需要放在-70℃以下进行保存。

同样，在兽医临床上对于发病动物的采样，尤其是采集样本比较多时，或者是夏季采样，一定要尽快完成，争取在4h内完成，对于病死动物需立即采集，否则会出现组织器官的腐败、变质或变性等现象，这将严重影响检测结果的准确性。针对不同检测用途的样品有不同的保存方法，其中血清学检测，一般采集的血液立即置于无菌试管中密封，室温放置1h或37℃ 30min，之后进行冷藏保存，需较长时间转移时要加入适当的抗生素；病毒学检测需要使用含有甘油的保存液低温保存。

样本转运时要严格遵守国家对感染性物质的运输要求进行包装和运送，须在专用的转移箱中运送，不要与其他物品混杂。防止病料的外漏，根据检测目的以最快最直接的途径送往检测实验室。另外，对于转运及存放标本的容器使用前后及时用 75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。

5、样本的处理不当

对于感染性物质的检测，如新冠病毒，在处理前先进行病毒灭活，如56~60℃孵育30min，或用试剂盒自带的采样液灭活病毒。兽医临床上，很多采集的病料其传染性也很难估计，因此最好是灭活后再进行检测，但是，要注意灭活的条件，避免病毒的核酸降解。

6、核酸提取操作方法差异

目前，常用的核酸提取方式有两种，即手工提取和核酸全自动提取仪提取。手工提取过程复杂，步骤繁多，容易交叉污染，而且操作人员掌握的分子生物学知识和操作技能的熟练程度差异较大，很难做到统一的标准化，而全自动核酸提取仪操作可以避免个人手工操作的差异，易于标准化，但在提取过程中可能产生气溶胶，进而交叉感染出现“假阳性”现象，同时不同的提取试剂对最后提取到的核酸数量和质量也可能存在差异。因此，提取的核酸数量和质量的不同，对将来的核酸扩增至关重要，直接会影响最后的检测结果。临床上通过核酸进行病原学的检测，如果采用手工方法提取，一定要严格规范操作过程，使用全自动核酸提取仪提取，在每次提取后要对提取仪喷洒核酸清除剂，然后用纸擦拭干净，最后用75%酒精喷洒擦拭（磁棒除外），紫外灯再至少照射半小时，来最大程度的减少核酸提取过程的污染，提高提取核酸的数量和质量，充分保证检测的准确性、可靠性。

首页前一页1234后一页尾页