由新冠病毒核酸检测引发的兽医实验室核酸检测的思考

自新冠肺炎疫情发生以来，全世界都在关注新冠肺炎的相关知识，尤其是防治措施，科研人员与医护人员全力研究新型冠状病毒（COVID-19，以下简称新冠病毒）的检测诊断及其防治措施。COVID-19是一种RNA病毒，其RNA有自我复制和逆转录两种复制方式。病毒在复制过程中容易发生变异，这是RNA病毒的一个共性，如原本为低致病性禽流感病毒株（H5N2、H7N7、H9N2），可经6~9个月禽间流行迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1），这给有效疫苗的研制增加了困难。为了减少病毒的散播，更好地控制传染源，需尽早确诊感染者，病原学检测成为患者确诊的主要依据之一，而病毒核酸检测是病原学检查的快速诊断方法。

一、核酸检测的原理及意义

临床常用的核酸检测技术主要有常规PCR、套式PCR、实时荧光PCR和等温扩增技术等。新冠病毒是通过特定细胞表面的受体入侵细胞造成感染，并利用宿主细胞进行复制增殖，引起宿主发病。病毒核酸检测的原理，即根据病毒碱基寻找区别于其他病毒的核酸序列，由此设计引物或探针，实现核酸序列的“靶向匹配”；再通过细胞裂解液，提取病毒核酸，实时荧光RT-PCR扩增40次循环以上，使其核酸数量可达到足够通过荧光等常规方法进行检测。其中最关键的就是引物和探针的设计，使之与该病毒核酸特定区域高度匹配，即特异性很强，一旦待检标本PCR扩增结果为阳性，则证明该标本中存在该病毒核酸。

我国颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》中明确指出，鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸为阳性，可作为新冠病毒肺炎的病原学诊断之一，而且下呼吸道标本（痰或气道抽取物）更加准确。但在疫病发生初期有人报道称，新冠肺炎患者中核酸检测的阳性率约为30-50%；而钟南山院士发布的近1100例新冠肺炎患者临床数据CT检查显示，76.4%的患者呈现了肺炎表现，主要为毛玻璃样阴影（50%）和双肺斑片状阴影（46.4%），绝大多数重症患者都能以此确诊。可见，核酸检测不能作为确诊感染的唯一手段，需要结合患者的临床症状和临床影像学检测综合分析。由此，我们需要进行思考，样本的新冠病毒核酸检测为什么阳性率不高呢？这就需要客观地分析疾病的发展过程、样本采集、样本的保存和运输、核酸的提取、扩增体系以及人员操作等诸多方面的因素，同时实验室检测不能离开临床症状资料的分析。

二、影响核酸检测的因素

1、患者病情不同

根据深圳市第三人民医院（南方科技大学第二附属医院）国家感染性疾病临床医学研究中心的人员对来自213 名COVID-19 确诊病例的866 份样本检测结果进行的分析，结果显示，发病后0~7 天采集的痰液、鼻拭子、咽拭子三种类型样本中，核酸检测阳性率仅为60%；而且随着病程发展三种类型样本阳性率均有所降低。表明新冠肺炎患者不同的病理时期机体内存在的病毒量不同，不同患者个体病毒存在的主要部位不同，虽然都出现病毒感染，但在相关的部位采集的病毒量较少或根本采集不到病毒，以至于通过实时荧光RT-PCR方法检测不到。如禽流感的潜伏期从数小时到数天，最长可达21天，临床检测采集样本时需采集早期感染的样本。任何疫病都有一定的潜伏期，不同的个体潜伏期长短不一，潜伏期的长短受多种因素的影响，如病毒的毒力、感染的病毒量、患者的大小和品种、营养状况、环境及应激因素等。有的在采样时感染可能发生数天或数周，不能确定标本采集时是否是样本采集的最佳时期。此外，在感染早期临床症状不典型，或病毒复制数量达不到qRT-PCR检测的阈值，所以这些都不可避免会出现无法检出的现象。因此，在出现疑似病例，尤其是疫病高发地区、流行区要连续采集样本，多次检测，结合临床症状综合分析检测结果。因此临床上，任何疫病的确诊都不能仅靠病原学检测1次阴性结果就做出疾病排除性诊断。

由此我们设想，如果发病动物经初步诊断可能是病毒性感染，须在动物发病的初期或急性期进行样品的采集，否则机体的免疫系统会吞噬病毒，导致病毒数量减少甚至消失，不易检出，而且临床上病毒感染的晚期极易继发细菌性感染，从而增加检测判断的干扰。兽医临床检测动物活体采样时，一定要选择有典型病症而且未经治疗的病例，这样可以获得动物传染病的基本信息，同样这对细菌学的检测也是至关重要的。对于群体性感染发病的情况，至少要选择5个动物进行样本的采集，每个动物的样品材料要有足够的数量，这样不仅要保证本次的检测顺利，也要为复检准备充足的样品。

2、样本采集部位偏差

要想提高核酸阳性检出率，首先要保证样本采集部位的准确性。新冠肺炎患者临床症状主要表现发热、干咳、乏力，有些伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等。针对新冠病毒检测的采集，国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中指出，鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸，第六版的指南建议采集痰标本，而在第七版提出下呼吸道标本（痰或气道抽取物）最准确。但临床病例个体情况差异较大，有的患者无痰，有的下呼吸道的肺泡灌洗液标本采集不便，导致上呼吸道采集的样本病毒含量低或不含病毒，致使检测结果差异较大。

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