非洲猪瘟诊断技术研究进展（一）

1.2.6重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymerise amplificarion,  RPA)   RPA是一种等温DNA扩增技术，已成为用于分子诊断的有吸引力的PCR替代方法。RPA反应在恒定温度下即可进行，不需要昂贵的热循环仪，对粗制样品具有高度抗性，并且反应可在约20 min内完成。与实时PCR相比，简单、经济，快速。 Wang等设计靶向p72基因保守区域引物和外切探针，以含有p72基因的重组质粒为模板建立RPA方法。此方法最低限度可检测每个反应102个拷贝，灵敏度与RT-PCR相当，与常见猪病毒无交叉反应，特异性良好。Miao等以ASFV p72基因建立RPA与侧向流试纸方法(RPA-LFD}，对ASFV的敏感性为38°C 10 min内每次反应达150个拷贝，与其他猪病毒无交叉反应，但易出现核酸污染，因此操作需要小心，而其简单、便捷、经济等优点，为ASFV现场检测提供了新的替代方案。

1.3小结

病原学检测是针对病原体自身的检测，能够在ASF暴发早期，检测出动物体内是否带毒，相较于抗体检测更快一些。病毒分离操作复杂，适用于病毒分子研究;核酸PCR类检测比较普遍，灵敏性很高，操作便捷，但核酸污染易出现假阳性，可用作鉴别诊断;LAMP, RPA等等温扩增检测方法快速简单，不依赖复杂仪器，现有专为户外使用而设计的RPA类便携式设备Genie III，轻便易于携带，更适用于现场诊断。病原学诊断方法各有特点（表1），检测人员可根据其优缺点选择合适方案进行诊断。

2 血清学诊断技术

2.1抗原检测

2.1.1荧光抗体技术(fluorescent antibody test,FAT)   FAT是常用的抗原检测方法之一，具有快速、敏感、特异性高等优点，对急性病例的检出率较高。FAT育邑够检测组织涂片或HAD阴性白细胞培养物中的ASFV抗原。采用丙酮固定样本10 min后，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)偶联抗ASFV抗体，再用荧光显微镜观察巨噬细胞的胞浆中是否有荧光，即可据此判断是否为阳性。现已证明，此种技术可用于鉴定12种非血细胞吸附ASFV毒株。但此技术所需的冷冻组织切片要求在B SL-3实验室进行，所以不能用于现场检测。此外，该技术对亚急性和慢性ASF病例敏感性较差，因在慢性感染过程中形成的抗原抗体复合物可竞争性地阻断ASFV抗原和抗体的结合，从而出现假阴性，因此一般只用作辅助检测方法。此外，荧光抗体技术通常也用于ASFV的体外细胞培养，通过病毒定位检测复制类型等。

2.1.2双抗夹心ELISA或捕获ELISA这种方法是在特异性单抗包被的酶标板中加入抗原，使抗原与单抗特异性结合，再加入抗原另一表位的酶标单抗，结合后加底物显色，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。Vidal等建立了抗ASFV vp73蛋白特异单克隆抗体的双夹心ELISA方法。该测定法能检测到的最低全病毒颗粒为2.3 X lOz PFU/mL,最低能检测到的vp73抗原浓度为0.05 pg/mL。西班牙IN GENASA夹心ELISA试剂盒，通过包被p72 (p73)蛋白特异单克隆抗体来检测病毒抗原，其特异性、敏感性均很好，并被OIE指定为参考的ASF诊断试剂盒。

2.1.3侧向流动免疫色谱分析(lateral flowassay,  LFA)   LFA是利用生物学物质或化学物质相互特异性附着的性质，快速对分析物质进行定性或定量分析的方法。Sastre等基于vp72蛋白的单抗建立LFA方法，结果表明病毒的最低检测限度为104 PFU/mL，虽敏感性不如RT-PCR，但其快速便携、经济易用，为现场诊断提供了一种选择。此外，Sastre等还基于vp72蛋白建立双重侧向流动测定法，用于同时检测针对ASFV和CSFV的抗体，结果显示也具有良好的灵敏度和特异性水平。

2.2抗体检测

2.2.1酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay,  ELISA)     ELISA是OIE指定的非洲猪瘟首选血清学诊断方法，其方便快速、敏感特异，并可使用自动化设备检测大量样本，为目前最广泛的血清学检测技术。国内外常用作检测ASFV抗原的蛋白有p73, p72, p54, p32/p30等，ELISA方法通过这些蛋白能够直接检测出较低或中等毒力的感染猪抗体。常规ELISA使用来源于感染猴肾细胞(Vero或MS细胞系)的病毒蛋白p72抗原。Wardley等在1979年首次使用ELISA鉴别ASFV抗原和抗体，重复性好，能够检测到50500 HAD50/mL的有限抗原浓度。靳雯雯等以ASFV vp73蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA方法检测猪血清中抗ASF vp73蛋白的抗体，对ASFV阳性血清灵敏度高达1:2 560，具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性。

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