非洲猪瘟诊断技术研究进展（一）

摘要：非洲猪瘟是猪的一种急性、高度接触性传染病，致死率可达100%。本文综述了非洲猪瘟病原学和血清学诊断技术研究进展，包括红细胞吸附试验（HAD）、聚合酶链反应技术（PCR）、环介导恒温扩增技术（LAMP）、荧光抗体技术（FAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和胶体金快速免疫层析技术（GICA）等，并对各种方法的优缺点进行简要汇总分析，总结认为今后非洲猪瘟诊断的发展趋势在于不同诊断技术的联合应用。

非洲猪瘟(African swine fever,  ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,  ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高致死性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。因ASFV存活时间长、抵抗力强，以及基因组庞大、易变异，至今仍无商业化疫苗可用，但有多种诊断技术可用于ASF监测和确诊。本文论述了ASF的病原学、血清学诊断技术并分析了其优缺点，以便为不同需求的诊断提供相应的技术支持。

1 病原学诊断技术

1.1病毒分离与检测

1.1.1病毒分离ASFV分离必须在BSL-3级及以上生物安全实验室中进行。临床样本可采集猪血液或器官组织，需要大量病毒时，可使用已建立的ASFV敏感细胞系，例如猴源的Vero和COS-1细胞，猪源的永生化猪肺泡巨噬细胞(IPAM)和野猪肺细胞(WSL) 。

1.1.2红细胞吸附(haemadsorption,  HAD)试验HAD是病毒感染巨噬细胞并在其中复制，导致红细胞吸附的一种自然现象，由ROSS等在1969年首次发现。实验室用采集的发病猪血液或组织悬液，接种猪原代巨噬细胞，每天观察细胞培养物中巨噬细胞表面是否有红细胞附着，若最终呈现玫瑰花环状或桑甚状，判为阳性结果并根据结果对样本的病毒量进行定量。尽管该方法灵敏性高、特异性强，但检测周期长、检出率低。自1968年西班牙首次发现ASFV以来，截至1974年，已分离出200多株不具备红细胞吸附能力的ASFV毒株，因此HAD不再是主要的ASFV检测方法。

1.2核酸检测

1.2.1聚合酶链反应技术(polymerase chainreaction,  PCR)   PCR是常用的核酸检测方法，其优点是简单快速、灵敏度高、特异性强，对标本纯度要求低，并已广泛用于ASF的现场诊断。该技术通常采用基因组高度保守区域vp72为引物，能够鉴定出ASF参考实验室提供的不同ASFV基因型分离株的基因组。曾少灵等基于ASFV结构蛋白基因vp73序列设计特异性检测引物，比OIE推荐的引物(ASFV-278F, ASFV-2788)和  (ASFV-257F, ASFV-2578)的灵敏度分别高出100倍和1 000倍，并且特异性相当。Basto等建立巢式PCR用以检测蜂体内ASFV，敏感性高于OIE推荐的PCR检测方法。多重PCR反应原理与一般PCR相同，而区别在于在同一反应体系中加入了两对以上引物进行扩增，因此具有高效性、系统性、经济简便等优点。Xiao等设计了7对特异性引物和探针，并进行了多重PCR, PCR产物与偶联探针杂交，然后通过Bio-Plex悬浮阵列系统检测新建立的方法，结果表明该方法具有高度的特异性和重复性，7种病毒的同时检测限达到10，拷贝枢Lo Bio-Plex悬浮阵列是一种快速、特异、高通量的工具，可单独或同时混合检测7种猪病毒，对于今后开发用于诊断动物疾病的液体芯片技术具有重要意义。

1.2.2实时荧光定量PCR ( quantitative real-time PCR,  qPCR)  qPCR利用荧光信号实时检测，不仅解决了传统PCR技术需要琼脂糖凝胶电泳判定结果的问题，而且速度快、灵敏度更高，最低检测限为10拷贝枢L o Tignon等基于ASFVp72基因建立的方法，其敏感性高于OIE推荐的常规PCR和实时荧光定量PCR。曾少灵等基于ASFV vp73基因保守序列建立的方法，其灵敏度与OIE推荐的荧光PCR方法相当，比普通PCR方法高出至少10倍，特异性与OIE推荐的这两种相当。

1.2.3微滴数字PCR （ddPCR） ddPCR是第三代PCR技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的技术。乌仔旭龙等基于ASFV K205R基因建立ddPCR检测技术，最低检测限为0.36拷贝，在20uL反应体系中约为10拷贝/反应，检测灵敏度是qPCR的10倍，并且不与其他猪病阳性血清发生反应，特异性强，具有很好的应用前景。

1.2.4原位杂交(in situ hybridization,  ISH)ISH是利用标记探针与目的核酸结合后再检测的一种技术方法，不仅能检测出待检核酸，还能在细胞中精确定位。Oura等建立了针对ASFV衣壳蛋白vp73的原位杂交技术，检测效果良好。

1.2.5环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,  LAMP )  LAMP是日本Notomi发明的一种敏感性很高的DNA扩增技术。该技术已成功应用于SARS、禽流感、艾滋病等疾病的检测o Heathe等以ASFV拓扑异构酶II基因为靶点建立了LAMP方法，其灵敏度不低于330个基因组拷贝数，能够检测到具有代表性的ASFV分离株((n = 38)，且不与经典的猪瘟病毒发生交叉反应。杨吉飞等基于ASFV结构蛋白vp72基因建立了LAMP检测技术，并成功应用于ASF参考实验室提供的17个ASFV毒株的基因组，与猪病的其他病原及传染媒介之间均没有交叉反应，只是LAMP中引物的相互作用可能会导致假阳性信号。该技术对设备要求低，适合基层诊断使用。

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