非洲猪瘟病原学诊断

2. 实时荧光定量PCR（RT-PCR）

实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进行实时监测。相比常规PCR方法，实时荧光定量更加快速，灵敏，减少交叉污染以及能够对监测结果进行定量。而且，实时荧光定量PCR可以使用96孔板，更加高效与自动化。目前已经有便携式的实时荧光定量设备，这将给未来的临床诊断带来根本性的改变。

King等首次报道的TaqMan实时荧光PCR详细步骤已收集在OIE手册中（OIE，2012）。该试验方法很敏感且又特异，可以检测到10到100个病毒基因的拷贝数。这个方法在25种不同非洲猪瘟病毒株以及非洲和欧洲16种蜱分离毒株中得以验证，而且与其它猪病没有交叉反应。Zsak等研究的另外一种基于VP72的TaqMan实时荧光PCR可便携的仪器，因此简化了试验前后的步骤。同时，这个方法有非常高的敏感性与特异性。与前一种方法相比，它可以检测到1.4到8.4个病毒基因的拷贝数。第三种实时荧光定量PCR是Mckillen等利用DNA双螺旋上的小沟（MGB）结合物探针来扩增非洲猪瘟病毒的9GL基因，它可以检测到至少20个病毒基因拷贝数，这种方法已经在15种非洲猪瘟病毒株以及相似猪病得以验证。目前由包括兰州兽医研究所等多家单位共同起草、由中国兽医协会发布的T/CVMA5-2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法在我国非洲猪瘟病毒检测中发挥重要作用。

3. 多重PCR

Felicity等已经建立了多重实时荧光定量PCR方法来同时检测和区分非洲猪瘟和猪瘟病毒。它的敏感性对两种病毒都达到了100%，它的特异性对猪瘟是100%，而对非洲猪瘟是97.3%。常规多重PCR可以同时检测出多种猪源病毒，该方法使用多对针对各自病毒的不同引物，因为可以扩增出不同条带的片段，因此可以在琼脂糖凝胶电泳中加以区分。虽然，它的敏感性比单一常规PCR降低10倍左右，但是，可以同时检测出多种猪源病毒。

4. 等温扩增反应

虽然RT-PCR方法在检测非洲猪瘟病毒时的敏感性和特异性都很高，但因为这些方法都需要比较昂贵的实验设备。等温扩增试验就为了基层等条件较为落后的实验室提供了一种选择。等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒是一种非常有效的实验室检测手段。相比较其他方法，等温扩增试验只需要一个恒温水浴锅，不需要昂贵的热循环设备。其中一种等温扩增方法是基于环介导等温扩增反应（LAMP）原理建立的检测方法，通过检测38种不同的非洲猪瘟病毒株来比较该方法与其他检测方法。结果显示，它可以检测出330个病毒基因拷贝数，敏感性低于其他试验方法。但是，对检测非洲猪瘟致死的猪群，这种方法的敏感性也很高。

四、RT-PCR、LAMP和抗原ELISA 检测方法比较试验

OIE参考实验室IAH-Pirbright通过试验比较了一种实时荧光定量PCR，一种商品化的抗原ELISA和一种LAMP方法。实验样品选自试验感染动物和疑似自然感染动物。对于试验感染动物，使用非洲猪瘟毒株（OURT88/1）攻毒感染后5天收集样品进行检测。RT-PCR和LAMP试验方法检测全部18头份都是阳性，RT-PCR的Ct值都比较低，表明了试验动物病毒DNA的拷贝数很高，LAMP试验方法在不到30分钟检测出所有阳性。抗原ELISA的检测结果发现只有14头份动物是阳性，3头份不确定，还有一头份是阴性。阴性动物对所有方法的检测都是阴性。这个结果表明了RT-PCR和LAMP在检测非洲猪瘟急性症状样品时的敏感性要好于抗原ELISA。田间样品选自2004到2009年来自加纳疑似感染非洲猪瘟病毒动物。在所有46份样品中，RT-PCR检测34份是阳性，LAMP检测33份是阳性。唯一的一份LAMP检测是阴性，但它的RT-PCR的Ct值也非常高。当LAMP的Tp值调到40时，它的敏感性就和RT-PCR一样了，这表明了Tp值在LAMP试验中的重要性。而将这些样品用于抗原ELISA时，只有14份是阳性，10份不确定性，22份是阴性。这个结果表明了抗原ELISA的敏感性要远远低于RT-PCR和LAMP方法，这可能是由于田间样品的纯度造成的。虽然抗原ELISA比RT-PCR和LAMP的敏感性都低，但当临床检测紧急爆发非洲猪瘟时，抗原ELISA还是能够成功检测出非洲猪瘟病毒。

五、结语与展望

综上所述，目前可用于非洲猪瘟病毒检测的诊断技术有病毒检测和抗体检测，本文主要介绍了病毒检测的方法。实时荧光PCR是最为广泛、有效的病毒学诊断技术，敏感、特异、快速并且高通量地实现非洲猪瘟病毒的检测。由于存在交叉污染的可能，应采取其他检测方法比对，并且结合血清学、病理学和流行病学调查的结果综合诊断。另外，由于PCR所检测到的阳性仅仅是病毒核酸阳性，因此，除PCR之外，在新的疑似感染地区报告疫情前，建议先从疑似样品中分离获得病毒才能确诊非洲猪瘟。

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