我国首例非洲猪瘟的确诊

摘要 ：近日，辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡，病死猪剖检发现脾脏异常肿大，疑似非洲猪瘟病毒感染。经国家外来动物疫病研究中心检测，确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性，B646L/p72 基因序列417 个碱基与俄罗斯毒株 100% 匹配， 与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒株（Georgia 2007）属于同一进化分支。这是我国发现的首例非洲猪瘟，疫情来源有待进一步调查。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达 100%。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV 不感染人，对人的健康不构成威胁。目前，针对 ASF 防控，尚无有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日，国家外来动物疫病研究中心接到辽宁省沈阳市沈北区发现 ASF 临床可疑病例的报告（图 1）。截至 8 月 1 日，发病猪场累计死亡 47 头，对刚病死的 2 头猪剖检发现：脾脏极度肿大，严重梗死，质脆易碎，其中一头猪脾肿大至少 10 倍，一头猪脾肿大 5~7 倍；肺出血、质硬，有间质性肺炎变化；下颌淋巴结、肠系膜淋巴结出血，切面呈大理石样变；胃浆膜面弥漫性出血；肾肿胀明显、色淡，未见出血点；扁桃体见陈旧性出血，符合 ASF 症状。国家外来动物疫病研究中心立即开展病原学检测，证实本次疫情由ASFV引起。这是我国历史上的首次 ASF 发病记录。

图1  发病场地位置

1　材料与方法

1.1　病料 

病原学样品：分别来源于 2 头病死猪的剖检病料，包括全血、脾脏、淋巴结、扁桃体；30 头临床健康猪的全血。血清样品：2 头病死猪及同群 30 头临床健康猪血清。 

1.2　病料 DNA 提取

在加有陶珠的组织匀浆管（Roche）中，加入600 µL PBS 缓冲液，再加入剪碎的组织样品约 30 mg，使用 HyBaid RiboLyser 组织匀浆机进行匀浆处理。取 200 µL 组织匀浆液和全血，分别使用病毒 DNA 提取试剂盒提取 DNA。最后将提取的核酸于 −80 ℃冰箱中保存备用。

1.3　荧光定量 PCR

依据文献报道，用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的荧光定量 PCR 方法进行 ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为 king-s/king-a，TaqMan 探针为 ASFVP，同时以本试验室合成的质粒 DNA 标准品为阳性对照。

1.4　普通 PCR

依据文献报道，用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的 PCR 方法进行 ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为 PPA1/PPA2，产物长度为 257 bp，同时以本试验室合成的质粒DNA 标准品为阳性对照。

1.5　测序片段 PCR 扩增

依据文献报道，合成扩增 p72 基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技术有限公司合成。采用高保真的 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 扩增 B646L/p72 基因片段，预期扩增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反应体系 为：2X Phusion Master Mix 25 µL，p72-D（10 μmol/L） 和 p72-U（10 μmol/L） 各 2 µL， 模板DNA 2 μL，用灭菌水补齐体积至 50 μL。PCR 反应程序为：98 ℃预变性 30 s；然后进行 35 个 PCR 循环（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最后 72 ℃ 10 min。

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