河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析

1.3　引物设计

根据 GenBank 已发表的 HP-PRRSV 变异毒株基因序列，分别设计 1 对包含缺失区段的 NSP2 基因上下游引物和完整 E 基因的上下游引物。引物分别由上海生工生物工程技术有限公司合成（表 2）。

1.4　病毒总 RNA 提取

将研磨好的组织病料离心，取上清液 200 μL，按照 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 操作说明进行核酸提取，最后用 50 mL DEPC 水溶解，于 −20 ℃储存备用。

1.5　NSP2 和 ORF5 基因 RT-PCR 扩增

将提取的 RNA 进 行 RT-PCR。反转录体系为：Random 6 mers（50 μmol/L）1.5 μL，dNTPMixture（10 mmol/L）1 μL，RNA 5 μL，H2O 2.5 μL，65 ℃ 5 min，立即冰浴；向体系中再加入 5×primerScript Ⅱ Buffer 4 μL，PrimerScript Ⅱ RTase 1 μL，RI 0.5 μL，H2O 4.5 μL，30 ℃ 10 min，70 ℃ 15min。PCR 扩 增 程 序 为：9 5 ℃ 5 min，95 ℃ 1min，49~51 ℃ 30 s，72 ℃延伸 40 s，32 个循环；72 ℃延伸 10 min。取 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 NSP2 和 ORF5 基因克隆及序列分析

回收 NSP2 和 ORF5 基因目的片段并连接到pMDTM19-T 载体，然后转化至 Top10 感受态细胞，进行菌液 PCR 鉴定。将鉴定的阳性菌液送上海生工测序。利用 Lasergene 软件进行核苷酸和氨基酸序列分析，使用 Mega 软件构建遗传进化树。

2　结果

2.1 NSP2 和 ORF5 基因扩增及克隆

经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，NSP2 和 ORF5基因扩增片段大小与预期结果相符。分别将各回收目的片段克隆到 pMDTM19-T 中，对含重组质粒的阳性菌液分别测序。结果表明，扩增得到的片段分别为 PRRSV NSP2 基因和 ORF5 基因（图 1、图 2）。

2.2 NSP2 部分基因序列分析

经序列测定，23 株 PRRSV 的 NSP2 部分基因序列长度为 486 bp；与 VR-2332、CH-1a 相比，均在第 481 位和 532~560 位缺失 30 个氨基酸；氨基酸序列同源性为 89.5%~98.8%，与参考毒株 VR-2332、MLV 的同源性为 63.6%~67.9%， 与 JXA1氨基酸序列同源性为 90.7%~98.8%。

2.3 ORF5 基因序列分析

经序列测定，最终获得 23 个流行株的 ORF5基因。基因总长度为 603 bp，编码 201 个氨基酸；氨基酸间同源性为 82.6%~99.5%，其中 20 个毒株（HB-SJZ、HB-SZJ1、HB-SJZ2、HB-BD1、HBBD2、HB-BD3、HB-HD1、HB-HD2、HB-QHD1、HB-TS、HB-TS1、HB-TS2、HB-CZ1、HBCZ2、HBHS1、HB-HS2、HB-CD1、HB-ZJK1、HBXL、HB-AG与 SY0608、SX-1、Henan-1、JXA1）的氨基酸同源性为 98.5%~99.0%，另 3 个（HB-HS、HB-CZ、HB-HD）与 NADC30 毒株的氨基酸同源性为 91.5%~92%，而与 MLV、VR-2332 同源性仅为 82.6%~88.6%。将 23 个毒株与国内外已发表的PRRSV 相应序列比较，并建立遗传进化树（图 3）。结果表明：获得的 20 个毒株与 SY0608、SX-1、Henan-1、JXA1 遗传关系最近，与 HB-1、HB-2 关系较近，属于同一个大分支，与 MLV、VR-2332处于不同分支；而另 3 个毒株与 NADC30 毒株处于另一分支，遗传关系较近。

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