3.2 样品或液体的添加 样品或液体的添加其实就是将液体从样品管、 稀释板或加样槽中转移到包被板中。这一步操作关键是正确及规范正确使用移液器， 需要注意的是在将液体加至包被板的微孔中时避免产生气泡或将液体加在管壁上部，另外在添加液体后避免用微旋振荡器进行混匀， 此细节针对不同工艺的产品会产生不同程度的影响。
3.3 孵育 孵育就是抗原抗体反应的过程。 不同的产品所设计的孵育温度有25℃、 37℃等，孵育时间有10、 15、 30、 60分钟等。 首先是要确保孵育的温度和时间正确无误，另外需要注意的是， 孵育时防止微孔板被的液体蒸发产生浓缩效果， 使整个实验本底升高，为了避免这个问题通常采用湿盒或封板膜。 另外就是需要考虑孵育时包被板内的液体受热的时间、 速度及均一度。
3.4 洗板液的主要成分是表面活性剂， 其主要的作用是洗掉没有参与反应的或非特异性结合的物质。洗板也是ELISA实验操作中影响比较大的一步，但是现在大多使用洗板机， 其认为操作带来的影响就大大减小。 如果采用手工洗板方法需要注意以下几点：洗涤液的稀释倍数及稀释所使用的溶剂， 添加洗涤液的体积， 浸泡时间和洗板次数。每一个因素都会直接影响到试剂的性能。
3.5 终止 反应终止液的成份主要取决于酶及底物的成份， 常用的终止液有氢氧化钠、氟化氢或硫酸， 这些液体都具有很强的腐蚀性， 使用时要注意安全，如果溅到眼睛或皮肤需要及时处理。 在实验过程中要在正确的时间进行终止， 终止之后孔内液体的颜色相对比较稳定，但是也会缓慢的变化， 有时候孔内会缓慢产生沉淀同时孔内颜色变浅， 需要及时进行读值。
4.数据读取及分析
4.1 数据的读取 ELISA实验数据的读取需要使用酶标仪。酶标仪在使用之前需要预热30分钟以上， 读数时注意选择正确的波长。酶标仪读数常采用单波长或双波长两种方式， 如果条件允许尽可能选择使用双波长。 因为双波长读数可以消除孔内非特异性反应所带来的对发射光的吸收值，如果使用单波长， 则这些影响因素可能对检测结果带来影响。
4.2 数据的分析 实验数据的分析分为COV值的计算及结果判断和数据的统计分析两个部分。 COV值的计算方法不同试剂盒差异较大， 有直接采用固定值或临界对照、阴性对照加上或乘以一个系数、 阳性对照乘以一个系数或者计算标准曲线等， 总之严格参照说明书的要求进行结果判断，有些计算方法或公式在酶标仪上无法直接设置的就需要进一步电脑换算。 另外， 有些试剂盒还需要设置空白对照［1］，需要将样品孔的吸光度值减去空白对照孔后进行COV值计算。数据的统计分析主要根据实验目的可以进行板内重复性分析（一般是计算变异系数）， 批间差异分析 （一般进行相关性分析），不同产品的检测结果差异分析 （计算Kappa值或进行卡方检验），实验数据的长期观察分析 （需要进行画图进行趋势分析） 等。
5. 总结
ELISA检测技术看似比较简单，但是每一个部分、 步骤或因素均可能影响到整体的实验结果， 如果全面展开将是一个比较大的课题，在此本人只是将一些关键的环节点到为止。 ELISA检测的很多细节还需要在实际工作中不断的摸索、思考和总结。
|
