451、分子生物学实验室布局应该各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流,形成单向流程的保护屏障,避免实验之间的相互干扰,防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。 452、在HA试验中,能使红细胞完全凝集(100%凝集,++++)的抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位(HAU)。 453、已知禽流感原始抗原效价为1:256时,配制4单位抗原64毫升则需要原始抗原1毫升。 454、制备禽流感HI试验的鸡红细胞悬液,至少需3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡提供红细胞。 455、正向间接血凝试验是将可溶性抗原致敏于红细胞表面,用以检测相应抗体;反向间接血凝试验是将抗体致敏于红细胞表面,用以检测相应抗原。 456、ELISA是酶联免疫吸附试验,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。基本反应类型有间接ELISA、(双抗体)夹心ELISA(或捕捉ELISA)、竞争ELISA(或阻断ELISA)。 457、ELISA反应中,加入底物液后的避光反应,应严格执行说明书时间,并非时间越长,反应越充分,颜色对比越明显。 458、进行ELISA试验时,试剂盒拿出冰箱后,应达到室温后再进行检测。 459、不同批次的ELISA试剂盒,不可以通用。 460、ELISA试验中最佳常用底物是3’3’5’5’-四甲基联苯胺 (TMB)。 461、间接ELISA方法的主要原理、试验步骤、结果判定方法: (1)基本原理:把抗原在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面;测定时,将受检样品和酶标记物按一定程序反应形成复合物,并加入酶作用的底物;反应终止时,根据定性或定量分析有色产物的量来确定待检样品中的抗体的含量。 (2)试验步骤:抗原包被→洗涤封闭→加待检血清(同时设立阴阳性对照)→反应一定时间→洗涤→加酶标二抗→反应一定时间→洗涤→加底物溶液→反应一定时间→终止反应→判定结果。 (3)结果判定:肉眼观察或仪器测定,可以阳性与阴性表示结果、以P/N比值表示结果、以终点滴度表示结果或以标准曲线进行定量测定。 462、斑点-ELISA: ELISA实验在硝酸纤维膜上进行,抗原(体)点样呈斑点,反应结果观察斑点的呈色。 463、口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体检测方法可用于区分野毒感染动物与疫苗免疫动物。其原理是动物在感染口蹄疫野毒后既产生结构蛋白抗体,也产生抗体,而接种口蹄疫疫苗(疫苗毒经过纯化,去除了病毒的非结构蛋白)后,应只产生结构蛋白抗体。 464、对口蹄疫疫苗多次重复免疫的动物进行非结构蛋白(NSP)抗体检测,出现阳性反应时应判定该动物存在口蹄疫野毒感染,但也有可能是。假阳性的原因一是由于疫苗毒的纯化存在问题;二是由于疫苗制备时允许痕量NSP存在,多次重复免疫动物所致。 465、PCR即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),具有特异、敏感、快速等特点。扩增反应包括3个步骤,变性、退火(复性)、延伸3个步骤。 466、PCR反应体系的基本成分由耐热的DNA聚合酶、引物、 dNTP、 Mg2+、缓冲液、模板组成。 467、PCR引物长度一般为15~30个核苷酸。过短时影响PCR的特异性,过长时会提高相应退火温度,使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。 468、提取病原核酸,经氯仿去除蛋白质时,离心后上清应小心操作,靠近沉淀的那层膜,一定不要吸取,以免蛋白质污染。 469、采用异硫氰酸胍提取病毒RNA时,第一次离心完毕后,上层水相中含有RNA。
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