宋姗姗 刘兴彩 冯敬敬 李建丽
（天津瑞普生物技术股份有限公司 300000） 摘要：本研究对2010年到2012年我国河北、河南、江苏、安徽、山东、天津、湖北、湖南、山西、甘肃和四川等省市的养殖场的鸡群的喉、泄殖腔拭子进行了 H9 亚型 AIV 的病原学检测，共检测1707份样品，检测阳性率为15.29%。对检测H9 亚型 AIV阳性的病料进行病毒分离鉴定，并选取14株分离株进行HA基因序列比对，分析 HA 基因变异情况与分子进化特点与变化，丰富我国的 H9 亚型 AIV序列数据库，为H9亚型AIV的防控以及疫苗免疫提供参考依据。
关键词：H9亚型禽流感，HA基因，基因进化分析 禽流感（Avain Influenza,AI）是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起禽类传染性疾病，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病。根据对禽类致病力的高低，禽流感有分为高致病性禽流感（High Pathogenic Avain Influenza,HPAI）和低致病性禽流感（Low Pathogenic Avain Influenza,LPAI）或温和型禽流感（Mildly Pathogenic Avain Influenza,MPAI）[1]。
MPAI 虽不是烈性传染病，但因其基因来源丰富，分布广泛，对养禽业的危害也很大。而 MPAIV 中尤以 H9 亚型分布最为广泛、最具有危害性。虽然该亚型 AIV对禽群呈低致病力，主要临床表现仅为轻度呼吸道症状，但由于易与其他致病微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起了禽群的高发病率和致死率，对养禽业造成巨大损失。近几年，对我国部分省、市、区商品蛋鸡场及养鸡专业村进行禽流感血清学调查中发现，H9 亚型阳性鸡群占总的 AIV 抗体阳性鸡群的 93.67%，其中绝大部分是 H9N2 亚型 AIV[2]，这说明 H9N2 亚型 AIV 在我国广泛存在，且流行情况较为复杂，存在着多个不同的基因型。由于其分布广泛并目呈逐渐蔓延之势，因此给养禽业造成的威胁是巨大的，严重制约了养禽业的发展。本研究对我国河北、河南、江苏、安徽、山东、天津、湖北、湖南、山西、甘肃和四川等省市的养殖场的鸡群的喉、泄殖腔拭子进行了 H9 亚型 AIV 的病原学检测，并进一步对分离出的部分 H9 亚型 AIV 的 HA 基因进行了全长扩增、测序与分析，绘制了 H9 亚 AIV 的 HA 基因系统进化树进行了分子进化分析。拟阐明这几个省份从2010年到2012年 H9 亚型AIV 的感染情况，分析 HA 基因变异情况与分子进化特点与变化，丰富我国的 H9 亚型 AIV序列数据库。
1 材料与方法
1.1 样品来源
采集2009~2012年我国河北、河南、江苏、安徽、山东、天津、湖北、湖南、山西、甘肃和四川等省市养殖场疑似流感爆发鸡群的喉、泄殖腔拭子样品。
1.2主要试剂和仪器
RIzol®LS Reagent，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2， DNA MarkerDL2 000均购于宝生物工程（大连）有限公司。
超净工作台（美国 Forma Scientific）、低温冷冻离心机（德国eppendorf 5424R型）、PCR 扩增仪（美国Bio-rad T100）、微波炉（格兰仕）、紫外光凝胶成像系统（美国Bio-rad）。
1.3引物
检测引物：按照农业行业标准《NYT772-2004 禽流感病毒 RT-PCR 试验方法》中对 H9 亚型禽流感病毒的 RT-PCR 检测方法的规定，选用 H9-732U/H9-732L 特异性引物扩增 H9 亚型血凝素基因片段，引物序列如下：
H9-732U 5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′
H9-732L 5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′
由上海生工生物工程技术服务公司合成。
HA 基因全长扩增引物根据 GenBank 上已经发表的禽流感病毒株参考序列设计扩增 HA 全长基因片段的引物，设计引物序列为：
上游 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3’
下游 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’
由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.4病毒分离鉴定
将气管拭子在离心管中反复振荡；12 000 rpm 离心 5 min，上清液用微孔滤膜过滤除菌。滤液作为接种样品，尿囊腔接种两枚 9-11 日龄 SPF 鸡胚，每枚接种 200 µL，之后 37℃饱和湿度孵育，每 12 h 观察一次，弃去 24 h 内的死亡鸡胚，24-72 h 死亡和未死亡鸡胚 4℃放置过夜后，收集尿囊液，分装并置-70℃冰箱保存备用。根据鸡胚死亡情况和微量血凝实验方法(HA)来判断是否有病毒存在。将HA>1: 8的标本采用血凝抑制方法(HI)进行流感病毒型别鉴定(标准血清购自哈尔滨兽医研究所)。
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