药敏试验的几种方法

6.2　牛津杯法

6.2.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

6.2.2　以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37℃培养8-18小时，观察结果。

6.2.3　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

6.3　打孔法：

该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

6.3.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

6.3.2　以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

6.3.3　加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

6.3.4　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

7.结果观察

在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

编辑本段判定标准一、药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

表1　药物敏感实验判定标准

抑菌圈直径（毫米） 敏感度

20以上          极敏

15~20           高敏

10~14           中敏

10以下          低敏

0             不敏

具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。

药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

8、影响因素培养基

细菌药敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO组织统一要求的M—H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此进行的药敏试验效果较好。此外，还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到触媒的作用。但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加5%羊血的巧克力M—H琼脂；肺炎链球菌的药敏实验用M—H琼脂加5%的脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。

细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca、Mg、A1等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。

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