正链RNA病毒复制酶结构与功能研究进展

    根据RdRp氨基酸序列的相似性和种系发生分析，大致可以将其划分为三个大的超群(I、Ⅱ和Ⅲ)。其中I群的代表病毒有小RNA病毒、野田村病毒、豇豆花叶病毒、线虫多面体病毒等；Ⅱ群的代表病毒有香石竹斑驳病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、单链RNA噬菌体等；Ⅲ群的代表病毒有烟草花叶病毒、甲病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒等。三个超群的RdRp都缠绕折叠形成一个准确的包围着八个保守基序(I一Ⅷ)的结构，其中四个基序存在于各类的聚合酶中，包括DNA依赖的RNA聚合酶(DdRp)、DNA依赖的DNA聚合酶(DdDp)和RNA依赖的DNA聚合酶(RdDp)。在这八个保守基序中，只有五个氨基酸残基是所有聚合酶中完全保守的，它们分别是基序T中的Lys3基序Ⅳ中的Asp118和Asp124及基序Ⅵ中的Asp1268和Asp269。当然，这三个超群的聚合酶在序列上也是有相互关系的，虽然有些氨基酸残基较为保守，比如，一个超群中的一些保守性残基也存在于其他的超群中。RdRp与病毒蛋白和一些宿主细胞因子一起组成复制复合物，共同执行复制酶功能。例如，脊髓灰质炎病毒的复制复合物包含宿主的Poly(C)和Poly(A)结合蛋白(分别为PCBP和PABP)、多聚酶前体3CD和EF-lα等。

    2、RdRp的氨基酸序列与高级结构

    2.1  RdRp的氨基酸序列特征  目前，一些重要RNA病毒的RdRp的结构与功能研究已经取得重大进展。如脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)等的RdRp晶体结构已基本阐明。RdRp结构域的N 端残基包含了部分多肽链，在位置和构型上与RdRp对应的残基不同，剪切了的N 端插入到一个结合袋中与许多氢键结合。

    前文提到的三个超群中，每个超群都有其标志性的保守氨基酸残基，包括：超群I中的Lys/Argl2(基序Ⅰ)、Arg27(基序Ⅱ)、G1y72(基序Ⅲ)、Phe/Tyr339(基序Ⅶ)；超群Ⅱ中的Arg32(基序Ⅱ)、Ser/Thr128(基序Ⅳ)、Cys340(基序Ⅶ)、Arg/Lys365(基序Ⅷ)；超群Ⅲ中的Ser/Thr190、Thr/Ser200(基序V)。值得注意的是，这些标志性的氨基酸残基在各个超群的次要成员中也是保守的。另外，虽然有些病毒的聚合酶的亲缘关系很远，在一些保守基序中却表现出很高的相似性。例如，马铃薯Y属病毒和冠状病毒聚合酶的基序Ⅲ和小RNA病毒聚合酶的基序Ⅶ。

    正链RNA病毒聚合酶多肽链的保守区域规则地分布在C-末端附近(除了豇豆花叶病毒组和线虫传多面体病毒)，小RNA病毒的聚合酶是所有正链RNA病毒中最小的，整个多肽链中60%都是保守性的区域，说明这些保守性基序可能包含了RNA延伸中的大部分氨基酸残基。

2.2  RdRp的高级结构特征  脊髓灰质炎病毒的RdRp的晶体结构是第一个被确定下来的很典型的聚合酶结构，同其他种类的聚合酶相似，呈右手型，具有三个亚结构域：掌型亚结构域(palm subdomain)、拇指型亚结构域(thumb subdomain)和手指型亚结构域(finger subdomain)(图l略(ii))。掌型亚结构域中的氨基酸序列呈高度保守性，在PV中，4段核苷酸基序(A-D，图l略(iii))相互折叠形成了掌型的中心区域，包括上面的2个α-螺旋和下面的4个反相平行的β-折叠片；C段中高度保守的GDD活性位点存在于所有的RdRp中；E段位于掌型亚结构域和拇指型亚结构域中间。拇指型亚结构域大部分是由α-螺旋化的C-氨基酸残基组成，还包括N-端的一个β-折叠片。手指型亚结构域包括四个不同的紧密的缠绕在一起的氨基酸序列，分别是：“食指”、“中指”、“无名指”、“小指”(图l略(iii))。拇指型亚结构域和手指型亚结构域之间的相互作用形成了一个完全包围着GDD活性位点的构象，而且，在聚合酶的后面形成了一个NTP的进入通道。PV的RdRp的这种拓扑结构和其他的小RNA病毒的非常相似(图l(iv))，包括人鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)和口蹄疫病毒(FMDV)的RdRp，尽管他们的一级结构有很低的同源性。此外，RdRp还有一个很重要的特点是有很多聚合酶之间相互作用的区域。

    3、RdRp的生物学功能与作用机制

    RdRp起始RNA合成的机制主要有两种：即引物依赖的RNA合成(primer-dependent RNA synthesis)和非引物依赖的RNA合成即从头合成(De novo RNA sythesis)两种方式。其中，前者根据所依赖引物的不同又可分为3种：蛋白引物，如小RNA病毒科的PV等；前导引物，如冠状病毒科的小鼠肝炎病毒等；模板引物，如嵌杯病毒科的兔出血症病毒等。后者根据起始位点的不同又可分为2种：末端起始，基因组不分节段的正链RNA病毒大多采用这种方式，如噬菌体Qβ采用3′末端从头合成机制起始RNA合成；内部起始，基因组分节段的正链RNA病毒大多采用这种方式起始亚基因组RNA的合成，如HCV能通过内部从头合成的方式起始RNA的合成。有些病毒只采用一种方式起始RNA合成，有些则采用两种或两种以上的方式。

    所以，RdRp的生物学功能与作用机制也有很多种，下面就目前研究的比较透彻的小RNA病毒科的PV来详细地阐述RdRp的生物学功能。

    在小RNA病毒中，病毒产生的多聚蛋白需要病毒编码的蛋白酶切割成成熟的蛋白，包括一些前体蛋白，在病毒复制的多个过程中起到了重要作用，PV的3CD^Pro是病毒蛋白酶3C^Pro和3D^pol(RdRp)的前体蛋白，具有多种功能。它具有与3C^Pro不同的蛋白酶切活性，但却没有聚合酶活性。它酶切产生病毒结构蛋白VP0、VPl、VP3和非结构蛋白3AB、3CD、3C^Pro、3D^pol。RdRp催化尿苷酸(uridine monophosphate，UMP)共价连接到小蛋白VPg的酪氨酸的N-端上，这个尿嘧啶化的VPg之后就作为RNA合成起始的蛋白引物。这个过程也被称为VPg的尿苷酰化作用。正链的合成被认为是利用PV基因组上的一个RNA发夹结构作为其引物。一种模型(图2略)认为在PV基因组上的2C非编码区上的顺式作用复制信号cre(2C)结合3CD与结合了VPg的3D^pol形成一个多组分的复合物。尿嘧啶化的VPg接着转移到病毒RNA的3′端，通过聚合酶开始合成VPg连接的RNA。

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