兔病毒性出血症诊断技术

时间：2011-09-21 点击：次来源：阳光畜牧网作者：阳光畜牧网 - 小 + 大

    在疫区根据流行病学特点，2个月以上家兔发病快、死亡率高并出现典型的临诊症状和病理变化，一般可以作出诊断。在新疫区要确诊可进行病原学检查和血清学试验等。
    1．病毒检查
    取肝病料1Q％乳剂，超声波处理，高速离心，收集病毒，负染色后电镜观察，可发现一种直径为25～35nm，表面有短纤突的病毒颗粒。
    2．动物试验
    该病毒只感染兔，其他动物不感染。取病兔肝、脾等组织悬液的离心上清液，经双抗处理后，以多种方式接种非免疫青年兔，可成功复制该病，并从患兔体内分离到该病毒。也可将病兔肝、脾做成1：10悬液，给试验组兔同时注射高免血清3mi和悬液1ml，另设几只注射病料悬液的对照兔，如试验组兔精神、食欲、体温均正常，对照兔死亡，可确诊是RHD。
    3．血凝与血凝抑制试验
    肝病料lo％乳剂高速离心后的上清液与用生理盐水配制的o．75％的人[)型红细胞悬液进行微量血凝试验，在4℃或25℃作用儿．凝集价大于1：160判为阳性(另外也能凝集人类B型，AB型红细胞，呈现强烈的阳性反应)。再用已知阳性血清做血凝抑制试验。如血凝作用被抑制(血凝抑制滴度大于l：80为阳性)，则证实病料中含有该病毒。
    血凝及血凝抑制试验快速、简单，成熟且易于推广，是确诊该病的良好方法。因为除兔细小病毒外，尚无类似疾病的家兔病料能凝集人O型血红细胞，并能被特异性抗体所抑制，因此也可用血凝抑制试验测定其抗体效价，进行免疫监测。血凝试验的方法有玻片法、血凝板法、瓷板法。
    4．免疫扩散法
将病兔肝脏乳剂制备的抗原对感染兔血清进行琼脂糖免疫扩散试验，可检出特异性抗体。戴康等发现，以甲醛灭活制备的抗原与抗血清反应时，粗提抗原可出现2～3条沉淀带，高度提纯的抗原则只出现一条沉淀带。
    5．红细胞吸附病毒——荧光抗体染色法(直接法)
    制备RHD高免血清，按常规法提取IgG，用F1TC标记。用l％人O型血红细胞悬液涂片，自然干燥，冷丙酮固定，4~C冰箱保存备用。病料加PBS(10倍，W／V)并匀浆化(1000r／mill，3min)，将悬液3000r／mill离心30min，取上清液加于细胞涂片上，室温吸附10min，PBS充分冲洗，晒干后加制备的荧光抗体，置37~C湿盒中染色30min，用PBS充分冲洗，蒸馏水冲洗除盐，干燥后置荧光显微镜下观察，可见到特异性荧光。
    6．Dot-ELISA试验(斑点酶联免疫吸附试验) 按杨汉春所建立的方法进行。
判定标准为：+十为呈深棕色斑点，与强阳性相似；十为呈浅棕色斑点，与弱阳性相似；一为未呈斑点，与阴性对照相似。
    7．分子生物学诊断技术有反转录——聚合酶链式反应(RT-PCR) Guttre等以5’末端衣壳蛋白基因为对象设计了RT-PCR和套式RTPCR，给果表明此法比ELlSA敏感10‘倍，可以检出至少12个拷贝的病毒核酸。
    在病毒性出血症检测方面，自1984年以来相继建立了一系列抗原、抗体检测方法。主要有血凝(HA)和血疑抑制(H”、琼脂扩散试验(1D)、免疫酶组化法(BA)、ELISA法、荧抗法、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)，DNA探针法等。
    虽然上述各种免疫学检测方法在RHDV的检测中有一些不可取代的优点，但各自仍有不足之处，或因存在不同程度的假阳性、假阴性和交叉反应，或限于实验室所需条件，在敏感、特异、简便、快速、实用等特点上均不够理想。因此，在RHDV的检测方面，急需建立符合上述特点的免疫学检测方法，并结合分子生物学技术等多种诊断方法对兔病毒性出血症作出确诊。

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