猪水肿病发病机理研究进展

3 SLT-IIe发挥毒性作用

3.1 SLT-IIe的发现

Timoney F（1950）将发生水肿病的肠道内容物离心后的上清静脉注射仔猪，可复制出水肿病，因而证实了水肿病不是由细菌直接引起的，而是其产生的一种毒性物质引起的，这种毒性物质存在于患病猪的肠道中。仔猪静脉注射致ED的大肠埃希菌抽提物后，24 h～48 h就出现了水肿病的临床症状，口服感染后约1周才出现临床症状，这表明致ED大肠埃希菌在消化道内产生了一种毒素。毒素作用的扩散依赖于宿主的吸收，因此认为仔猪水肿病是一种肠毒血症。Erskine R G等（1957）将体外培养的致ED大肠埃希菌反复冻融，从中抽提出一种物质，静脉注射健康仔猪，可引起与ED完全一样的症状和损伤，这个试验也证明了毒素是水肿病的主要致病因子[2，10]。

Konowalchuk J等（1977）首先发现某些大肠埃希菌产生一种能引起Vero细胞病变的毒素，并称之为VT毒素（Verocell toxin），因为这种毒素与志贺痢疾杆菌细胞毒素的生物学活性和作用方式极为相似，故称之为类志贺样毒素(Shiga-like toxin, SLT)。其与志贺样毒素Ⅰ型（SLT-Ⅰ）和志贺样毒素II型（SLT-Ⅱ）的特异性方面，SLT-Ⅰ和SLT-Ⅱ对Vero细胞和HeLa细胞都具有毒性，而水肿病毒素对Vero细胞的毒性明显高于对HeLa细胞的毒性。并且水肿病毒素比SLT-Ⅰ或SLT-Ⅱ更不耐热，不能被抗SLT-Ⅰ的血清中和，但抗SLT-Ⅱ的血清却能中和该毒素。因此，水肿病毒素被命名为类志贺样毒素Ⅱ型变异体（Shigalike toxin Ⅱ variant, SLT-Ⅱv），现称为SLT-Ⅱe，也称为VT2e、Stx2e。断奶仔猪腹泻和ED常发生于同一猪群，并且病原菌的毒力因子也有相似之处，Chen X等[16]研究表明，产SLT-Ⅱe的大肠埃希菌主要与ED有关，而致断奶仔猪腹泻大肠埃希菌只有25%是SLT-Ⅱe阳性。

Macleod等（1991）建立了一种毒素纯化的最佳方案，用此方案可制备出无内毒素的SLT-Ⅱe均质的制备物，并证实了SLT-Ⅱe毒素是由2个分子质量不同的亚单位组成，对Vero细胞具有毒性，对兔肠有微弱毒性，可致死小鼠，能完全复制出仔猪水肿病。SLT-Ⅱe的半数致死量LD是3 ng/kg猪体重。

3.2 SLT-Ⅱe的作用机制

SLT-Ⅱe是致仔猪产生水肿病的主要毒力因子，由1个分子质量为33 ku的A亚基和5个分子质量为7.6 ku的B亚基共同组成的聚合体。其中A亚基是水肿病毒素的主要毒力亚单位，为毒素的酶活性部位，具有细胞毒性作用。B亚基不具毒性，而具有免疫原性，是水肿病毒素保护性抗原的所在处[17]。A亚基的细胞毒性作用主要是通过A链的RNA-N糖苷酶活性切断28 S rRNA 5′端4 324位腺嘌呤的N糖苷键，腺嘌呤残基因此脱落，使延伸因子EF-1的氨基酰化tRNA不能与60 S核糖体亚基结合，从而阻断了细胞内蛋白质的合成，造成代谢功能紊乱，导致细胞死亡。

A亚单位具有很高的保守性[18]，包括A1和A2两个亚基，其中A1亚基是SLT-Ⅱe分子的接触反应中心，其N端存在毒素的信号肽序列，C端存在一个参与毒素分子跨内质网膜运输的跨膜区[19]。Hovde C J等(1988)通过X射线衍射技术对SLT-ⅡeA的立体结构进行观察，推测第167位的Glu及170位的Arg对维持其构象有重要作用。Gordon V M等(1992)利用点突变技术对SLTⅡeA的基因进行修饰，发现若将第167位的Glu突变为Asp，其毒力将下降104倍，酶促活性下降400倍；若将第170位的Arg突变为Lys，其毒力将下降10倍，酶促活性下降5倍；若将第167位及170位的Lys同时突变掉，其毒力将下降106倍，酶促活性下降1 500倍。

通过定点突变表明对Vero细胞受体发挥作用的氨基酸位于SLT-ⅡeB处。其不具有酶活性作用，但具有免疫原性，是水肿病毒素保护性抗原的所在处。SLT-ⅡeB能与肠上皮细胞的特异性受体结合，使SLT-ⅡeA通过“脂流”进入细胞内，从而A亚基可能发挥毒性作用。受体的化学本质已经明确。SLT-Ⅱe优先结合真核细胞的球丁糖基神经酰胺（Globotetraosylceramide,Gb4）和半乳糖红细胞糖苷酶（Galactosylgloboside，Gb5），而与球丙糖基神经酰胺（Globotriosylceramid，Gb3）亲和力较低，但志贺样毒素ShT，SLT-Ⅰ和SLT-Ⅱ仅结合Gb3。Gb3受体存在于Vero细胞，Hela细胞和仔猪肠上皮细胞上，Gb4主要存在于猪小肠上皮细胞及Vero细胞上，Gb5只发现于Vero细胞，这一点也就解释了为什么SLT-Ⅱe对Vero细胞有较强的毒性作用，而对Hela细胞的毒性较弱的现象，以及这种识别的差异可能与它们的B亚基的氨基酸序列有关[20]。猪红细胞富集有Gb4受体，SLT-Ⅱe在血液中的数量和比例，决定了上皮细胞结合SLT-Ⅱe的能力。体外试验表明，大多数SLT-Ⅱe局部活跃于猪全血样品的红细胞片段中，而在血浆中很少或不能检测到Vero细胞毒性；体内试验也表明，当静脉注射仔猪时，SLT-Ⅱe明显结合于红细胞，这可能是毒素转移到敏感组织的一种方式[21]。

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