邓宇1，2，王新华2*
（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；
2.新疆农垦科学院绵羊繁育生物技术重点实验室，
新疆石河子 832000） 摘要：牛病毒性腹泻病呈世界性分布，在许多养牛业发达国家尤其严重，造成该病广泛流行的主要传染源是牛群中存在持续性感染牛，因此建立起特异、敏感、简便且快速的诊断方法来检疫、淘汰持续性感染牛是防制该病的关键之一。ELISA因其特异性强，敏感性高，重复性好，方法快速、简便，设备简单等优点，而得到日益广泛的应用,愈来愈受到人们的重视。目前，应用ELISA检测牛病毒性腹泻病毒已有不少研究，主要包括抗原捕获ELISA、间接ELISA、ABS-ELISA、双抗体夹心ELISA、单抗夹心ELISA、竞争ELISA以及M-ELISA等。文章就这几种检测方法的研究进展进行了概述，为进一步控制牛病毒性腹泻病毒提供参考。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；ELISA；检测
牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）又称为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease virus,BVD-MDV）,或黏膜病病毒（Mucosal disease virus,MDV）,在分类学上属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）［1］，与猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）在血清学上发生交叉反应［2］，并能够突破宿主的特异性发生交叉感染，因此该病毒感染牛的同时还能够感染绵羊、山羊、猪、鹿及其他反刍动物。BVDV感染牛可引起多种临床症状——高热，白细胞减少，沉郁，下痢，大量流涎，减奶以至停奶，反刍停止，结膜炎，口腔黏膜充血并出现溃疡斑，孕牛可能流产、产死胎和畸形胎等,还可以引起牛的免疫耐受与持续性感染、免疫抑制［1］。长期以来，该病一直严重影响畜牧业的发展。同时BVDV还是牛源生物制品（血清、冻精、冷冻胚胎及疫苗等）的常在污染源，给畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失。因此，建立一种准确、快速检测该病的方法显得极为重要。目前用于诊断BVDV的方法很多，如琼脂扩散试验、病毒分离、荧光抗体试验、ELISA、PCR技术等。而ELISA具有独特的优点，该方法能检测大批样品，其所需设备简单，容易操作，而且具有特异、敏感、快速等特点，在控制和根除BVDV方面发挥着越来越重要的作用。
1 抗原捕获ELISA
Graham D A等［3］应用商品化的BVDV抗原捕获ELISA试剂盒检测214份牛血清来作为一种常规的监测，同时将其中的208份血清通过病毒分离法（VI）进行病毒的分离作对比。结果表明，抗原捕获ELISA和VI的灵敏度分别为45.8%, 47.8%；相应的特异性分别为95.3%,95.1%；用单克隆抗体从24份阳性全血样品中检出22份BVDV疑似血样。Vilek R W等［4］为了弥补捕获ELISA的不足，通过更改白细胞标本制作方法和调整阴性零界值来改进商品化的BVDV抗原捕获ELISA技术，以满足更加有效地检疫持续性感染（persistently infected,PI）牛的需求。采用RT-PCR对6 110份样品进行检测作为参比，其中的786份样品应用改良前的抗原捕获ELISA方法检测；剩余的样品用改良的抗原捕获ELISA进行检测，结果，与RT-PCR检出样品中BVDV阳性率相比，改良前的抗原捕获ELISA检出的阳性率为4.71%，改良抗原捕获ELISA为0.82%（阳性率由从4.71%降至0.82%），这一结果表明，改良后的抗原捕获ELISA方法的准确性有了进一步提高，更适合检测BVDV。
2 间接ELISA
孙泉云等［5］采用该方法以纯化BVDV包被酶标板检测奶牛血清和猪血清中BVDV抗体，结果表明，在24个奶牛场的720份牛血清中阳性率为0.57%(4/720)；猪群中阳性率可以高达92.7%（139/150）。Beaudeau F等［6］采用间接ELISA和血清中和试验两种方法同时对1 113份散装奶进行BVDV检测，结果ELISA的敏感性和特异性分别达到了95%和97%。
3 ABS-ELISA
ABS为亲和素生物素（avidinbiotin）。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。Thür B等（1997）应用ABS-ELISA对具有腹泻临床症状的284头牛进行BVDV检测，检出65头为阳性，经试验证实，该方法适用于未固定组织冰冻切片中的BVDV；可采取活牛的皮肤或死牛的甲状腺、口腔黏膜、食道黏膜、真胃黏膜进行ABS-ELISA检测。
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