2．8 AC-ELISA方法的重复性试验
用已建立的AC—ELISA方法对1份阳性抗原(BVDV细胞培养物)、1份阴性抗原(阴性细胞培养物)和4份疑似BVDV感染牛的脾脏组织分别在不同板间及板内不同孔间进行重复检测，结果见表4。根据SSPS 8．0统计软件中的随机单位组设计资料的S-N-K方差分析方法进行分析。不同板间比较，F=0．833，P=0．479>0．05；板内不同孔间比较，F=0．103，P=0．958>0．05。二者差异均无显著意义，说明AC-ELISA方法在不同板间和板内不同孔间检测同一样品差异不显著。根据公式CV=S／Xx100％计算，6个样品在板内和板间的总变异系数均小于10％，可见该方法无论对阴、阳性细胞培养抗原还是临床组织样品进行检测均具有较好的重复性。
2．9 AC-ELISA在临床牛病毒性腹泻病样品检测中的应用
用AC—ELISA方法检测临床采集的牛病毒性腹泻病料，同时以病毒分离和RT-PCR方法检测做对比。用AC-ELISA、病毒分离和RT-PCR方法对11份临床牛病毒性腹泻病料的检测结果分别见表5，3种方法对12份健康牛组织样品的检测结果均为阴性。
3 讨论
牛病毒性腹泻至今仍是世界范围内严重威胁养牛业健康发展的传染病，各国对该病都十分重视，投入很大的人力和物力进行研究。就目前BVDV的诊断技术研究水平来看，远远滞后于BVDV其他方面的研究进展，如何建立快速、准确的BVDV检测方法是当前BVDV防制工作的迫切要求。多年来，国内外先后建立了病毒分离、免疫荧光试验、单层免疫酶、酶联免疫酶和RT-PCR检测方法。ELISA方法以其快速、灵敏、简单并便于同时检测大量样品而受到人们的重视。目前国内BVDV检测方法还是以初步纯化的BVDV细胞培养物作为抗原检测BVDV抗体为主，缺乏理想的BVDV抗原检测方法。由于国外抗原检测试剂盒价格过于昂贵，在国内难以推广，建立一种敏感、快速、易操作的直接检测牛病毒性腹泻病抗原的试验方法已成为BVDV诊断工作的迫切要求。本试验用自行研制的BVDV单抗与兔抗BVDVIgG联合应用，建立了双抗体夹心间接ELISA方法用于捕捉BVDV抗原，将单抗的高度特异性和ELISA方法的高度敏感性有机地结合起来，达到了BVDV早期诊断和快速检测的目的。AC-ELISA方法具有快速、经济和敏感等优点，明显优于病毒分离、IPMA和IFA等，而且具有半自动化的特点，能自动显示结果，因此更适宜于短时间内检测大批量样品，适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。
在AC-ELISA方法的建立中抗体的亲合力是试验成功的关键，只有制备出高效价、高亲合力的特异性抗体才有可能取得成功。我们研制的单抗效价高，亲合力强，为方法的建立打下了良好的基础。同时制备了兔抗BVDV高免血清并纯化了IgG，取得了较好效果。
非特异性反应是影响ELISA结果最重要的因素，特别是在双抗体夹心ELISA中，参与反应的成分多，需要多重抗原抗体反应步骤，因此降低非特异性反应尤其重要。在消除非特异性反应过程中，封闭剂的选择和合理应用非常关键。由于担心动物血清中未知杂蛋白含量过多，有可能对试验结果造成影响，本试验中采用BSA和明胶作为封闭剂，并进行了封闭方式筛选试验，确定了将1％BSA和1％明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭，取得满意效果。
ELISA方法中结果的判定与特异性和敏感性密切相关，目前还没有统一的判定标准，一般公认的判定方法是通过检测大量已知的阴性样品，用统计学方法计算结果的平均数、平均数的99％可信区间和标准差，确定一个在99％的可信度上区分阴、阳性结果的临界值。张札壁报道对10份以上已知阴性样品分别检测，取OD值平均值加上3倍标准差的和可作为临界值，当被检样品的OD值高于此值时，可判定为阳性。本试验中应用24份经病毒分离和RT-PCR方法鉴定为BVDV阴性的牛脾脏组织分别用AC—ELISA方法进行检测，采用平均数加3倍标准差的方法确定样品阴性临界值为0．393，根据统计学原则，凡未知样品的OD值高于此值时，可以在99．9％的可信度上判定为阳性，能够作为检测结果的判断标准。此外，本试验还设定了一个可疑值范围，对介于可疑区内的样品进行重检，减少了假阳性或假阴性结果机率。
总之，本试验建立的BVDVAC-ELISA方法将单抗的特异性和ELISA方法的敏感性有机地结合起来，能够短时间内准确、快速地直接检测大批量样品中的BVDV抗原，明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，而且具有半自动化的特点，能自动显示结果，更适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。
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