血清学方法 血凝和血凝抑制试验 1.血凝(HA)试验:该试验即使在死亡时间较长、病毒无污染性的木乃伊胎中也可检出抗原。 2.血凝抑制(HI)试验:是检测PPV抗体最常用的方法,一般采用试管法和微量法。利用HI检测人工感染PPV的猪,发现感染后5天即可以检测到相应抗体。12天~14天抗体滴度高达1024~4096,并能持续多年检出抗体。待检血清进行HI试验时需要首先进行灭活处理,然后再用红细胞吸附,以除去血清中的非特异性血凝素,再用高岭土吸附以除去或减少血清中非特异性抑制因子。该方法虽能快速、大量地诊断,但灵敏度低、特异性不强,在低滴度感染时难以检出,只能作为辅助诊断方法。 血清中和试验(SN) 血清中和试验是最经典、传统的血清学方法,它特异、敏感。其原理是利用被检血清的抗体中和PPV,然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。JOO等HI通过试验发现,SN比HI更敏感,但操作复杂。首先要进行病毒感染力的测定,才能进行中和试验,而且低剂量不能引起细胞病变,因此完成一次中和试验常需一周或更长的时间,用于临床诊断时效性太差。中和试验需要细胞培养技术和病变结果的判断,需要较高专业技术,不适于一般实验室和临床推广应用。 间接免疫荧光技术 早在1970年Cartwright等就用荧光显微镜检测细胞培养物中是否分离到了PPV。Morey等用HPVBl9囊膜蛋白单克隆抗体P92F5,以APAAP法进行免疫荧光染色,在石蜡包埋切片中检测到病毒抗原存在于胞核和胞浆中。这种方法可从长期保存的样品中检测到病毒。PPV的间接免疫荧光检测敏感、可靠,检测时间也短,一般几个小时就可完成检测。董齐等报道,将猪细小病毒高免血清和猪胎儿组织中的PPV抗原形成特异性的反应,再加兔抗猪IgG荧光抗体,建立了间接免疫荧光诊断技术,该技术应用于临床具有特异、敏感、快速的特点。 琼脂扩散试验 此法是一种操作简便、特异性较强的血清学诊断方法。可检查PPV抗原,也可检测PPV抗体。刘译等用此法取妊娠期延长,产死胎、木乃伊胎的初产母猪血清与抗原做常规琼脂扩散试验,结果均出现明显沉淀线。但GDP敏感性差,不能用于检测PPV抗原量少的样品。 酶联免疫吸附试验 1989年WesternbrinkF等建立了酶联免疫吸附试验(ELISA),经比较证明与HI的试验结果一致,并适用于大规模的样品检查。ShiraishiT等成功地建立用滤纸采取血样、用ELISA方法检测PPV抗体的方法,此法便于样品的采集和送检。Jenkins等应用酶联免疫吸附试验检测流产胎儿组织中的分布情况。张晓根等建立了间接Dot—ELISA.PPV抗原对纯化PPV抗体的最低检出量为2.5ng/点。阳性猪血清的特异性阻断试验及交叉反应试验证明.该方法对抗原的检测具有特异性。 乳胶凝集试验(LAT) 何启盖等(1999年)将灭活的PPV经硫酸铵沉淀、透析浓缩后的病毒液致敏乳胶建立了检测PPV抗体的乳胶凝集试验诊断方法。致敏的乳胶抗原与细小病毒阳性血清反应出现凝集颗粒。乳胶凝集试验可用于对临床大量血样进行血凝抑制试验前的初选,具有简便、准确的优点。该方法的不足之处在于它所检测的抗体主要是IgM,因此只能用于疾病的定性诊断,不能进行血清抗体滴度的监测。 ELISA双抗夹心法 是一种操作简便、敏感、特异,可用于快速诊断PPV的研究。姜永厚等报道,建立了从胎猪脏器中检测抗原的ELISA双抗体夹心法,并摸索了最佳试验条件,结果认为选择胎猪病料时非常重要,以肝脏中含毒量最高。 免疫电镜试验 此法通过制备标本、负染,可在电镜下直接看到抗原抗体的复合物,从亚细胞水平上定位Ag和Ab。侯喜林等(1997年)用此法,用免疫电镜在50000倍下可清晰见到聚集成团的、大小不一的病毒颗粒,近似六角形,无囊膜,直径大小约20纳米~22纳米,与血凝、琼扩、免疫电镜试验等检查结果相符。 分子生物学诊断技术 单克隆抗体(McAb)技术 单克隆抗体具有特异性强、效价高并可在体外大量制备等特点,已成功地用于许多疾病的诊断和治疗。1984年国外研制出了PPV的McAb并用于临床诊断。国内俞太尉等成功地制备了PPVNADL-2和PPV7909株的单克隆抗体,并与ELISA结合,将其初步应用于检测猪血清中的PPV抗体,同时与HI对70份血清进行检测对比,阳性符合率为97.5%,具有很高的特异性。
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