荧光定量PCR常见问题解答

这是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升。出现这种情况可以采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常，即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是3），基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如起峰是在第21个循环，那基线的终点就是20）。

引起这样的原因是由于选用的耗材、试剂或者操作的原因导致背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误。

2 耗材及仪器配件是否使用正确

很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。

（1）使用了普通PCR仪器的耗材

普通PCR耗材透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如杂乱的扩增曲线；

如上图所示：使用普通PCR耗材的结果

（2）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材

荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种，实验前一定要确定自己的仪器的模块类型，来选择对应的耗材。如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好，或者溶解曲线多峰，甚至是假阴性结果；

如图所示：耗材规格跟加热模块不匹配造成复孔间差异

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