|
1、4 PCR（聚合酶链式反应）法
PCR法是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。在白血病各亚型病毒的特定基因（gp37、gp85、P27、P12等）和全部基因的分析等方面具有基础性意义。对研究病毒的演化、进化和病毒的诊断具有重大意义。其基本过程是由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增，然后进行电泳检测。利用PCR的检测方式有多种，如荧光PCR、RT—PCR等。
PCR灵敏度高（1fg），能够检测到来自肿瘤组织、病毒感染的其它组织和细胞培养物中微量的白血病前病毒DNA，通过反转录PCR(RT—PCR)还可以检测白血病病毒RNA。对于内源性病毒的干扰，可以选取特定的基因片段（如pol）做引物来避免。
目前PCR法是相关科研单位常用方法，个别种鸡场也开始使用这种方法。由于这些方法需要专门的试验室、专业设备和专业人员，成本较高且无法做现场检测。这种方法也不适合种鸡场的大面积使用，一般种鸡场也没有能力做这些工作。
1、5小结
对一般种鸡场来说，没有能力去做病毒分离和组织病理诊断，PCR法因要求较高也不易开展，只有ELISA方法在很小范围得到应用。还有一个原因就是相关设备和试剂价格高，企业承担不起也不愿接受，如ELISA法检测一只种鸡的一项指标，市场要价在四十元左右，如果一个种鸡场养五万套种鸡，做全面检测就需要至少200万元，显然种鸡场无法接受，也承担不起。目前种鸡场对检测产品的要求有以下几点：一是产品灵敏度高、稳定性好；二是价格低廉，一头份费用在几元以内；三检测快速，最好在几分钟内完成；三是能现场操作，且操作步骤简单。
实际上，有一类科研产品能够满足这些要求。那就是白血病胶体金快速诊断产品。这类产品在将来有可能成为一种应用广泛的检测手段。
2、白血病胶体金快速诊断试纸
胶体金试纸是利用抗体、抗原胶体金标记技术和免疫层析技术进行抗原或抗体结合形成夹心免疫复合物并显色的技术。此类产品在禽流感、新城疫、法氏囊等疾病的诊断上已有很好的应用。由于金标技术是很成熟的技术，而白血病病毒的单克隆抗体和重组基因产物也有了很好的产品，所以白血病胶体金快速诊断试纸研发已具备很好的前提。因试纸产品具有灵敏度高、稳定性好、操作简便可现场操作、诊断快速、价格低廉且不需其它专业设备等特点，更容易为种鸡场大面积使用。所以大有研发的必要。今就有关思路进行简介，以供感兴趣的科研工作者参考。
2、1白血病试纸研发的具体思路
目前制作多种亚型病毒的检测试纸和通用试纸的条件都已具备，但据目前白血病流行特点来说，以下试纸应在研发上应优先考虑：
试纸一：普通型白血病抗原胶体金快速诊断试纸
检测线选用P27衣壳蛋白的一株单抗， P27衣壳蛋白的另外一株单抗或多抗与胶体金相结合（标记），质控线则选相应的二抗。这样的试纸可以检测所有的白血病病毒。
试纸二：J亚型白血病抗原胶体金快速诊断试纸
检测线选用J亚型病毒gp85表面蛋白的一株单抗，另外一株J亚型病毒gp85表面蛋白的单抗或多抗与胶体金结合，质控线则选相应的二抗。这样的试纸可以检测样本中是否有J亚型白血病病毒或检测到的白血病病毒是否是J亚型的。
试纸三：普通型的白血病抗体胶体金快速诊断试纸
检测线选用基因重组表达的P27衣壳蛋白，另一基因重组表达的P27衣壳蛋白与胶体金相结合，质控线则选择相应的抗体或单抗，亦可实验选用SPA。
这三个试纸恰当选用，既可检测白血病病毒，又可检测白血病抗体，还可以确定白血病病毒是否为J亚型的。基本能够满足种鸡场的检测要求。
2、2关于白血病胶体金试纸的检测质量提高的相关技术问题
目前常有的胶体金是中等颗粒的“红金”。以此为基础的产品，在检测过程中常出现“红雾”，从而影响检测线的结果观测。在研发出“红金”试纸后，如果有关科研人员想进一步提高试纸的检测质量，可以考虑应用目前国外个别公司开始使用的大颗粒“紫金”技术。以“紫金”为基础的试纸在检测过程中不出现“红雾”，从而能够大大提高观测的质量。
只是在研发过程中要注意以下两点：一是以“红金”为基础的数据到“紫金”处，不一定适用，要做一部分修改；二是“红金”下的稳定性与“紫金”下的稳定性不同，这里的稳定性有两个方面要考虑，一是抗体或抗原与胶体金的结合，另一个是产品的有效期的问题。
|
