2010-2012年H9亚型AIV分子流行病学分析

    1.5病毒RNA的提取
    参照 TRIzol®LS Reagent 的说明书稍加修改。具体如下：取含病毒的鸡胚尿囊液 200 µL，加 900 mL Trizol 裂解液，混匀，室温作用 10 min；加 200 µL 氯仿溶液，震荡混匀，室温作用 10 min；12 000 rpm，4℃离心10 min；小心吸取水相 600µL 加入到新的 DEPC 处理过的 1.5 mL 离心管中，加等体积的冰异丙醇溶液混匀，-20℃放置 10-15 min；12 000 rpm，4℃离心10 min，弃上清，加入 1 mL, 75%冰乙醇溶液，轻轻混匀洗涤；7500 rpm，4℃离心 5 min，弃上清，自然干燥后，加 30 µL DEPC 水溶解 RNA，-20℃保存备用。
    1.6 HA基因RT-PCR
    采用PrimeScript M-MLV RT-PCR Kit试剂盒进行RT-PCR反应,反应条件: 30℃ 10min, 42℃ 60 min, 72℃ 15 mim； PCR循环如下: 94℃ 4 min； 94℃ 45 s,52℃ 30s，72℃ 1min45s， 30次循环， 72℃10 min。
    1.7核苷酸序列测定
    PCR产物送往北京华大基因进行测序。
    1.8 H9亚型毒株的分子进化分析
    利用 NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）的 Influenza Virus Resource 数据库，搜索所有其收录的所有 H9 亚型 AIV 的 HA 基因序列，与测序结果一起进行在线 Alignment 初步对比后，利用 MEGA4.0 软件，初步绘制进化树，并选取代表毒株，继而进行近些年中国 H9 亚型 AIV毒株的 HA 基因的分子演化分析。
    2 结果
    2.1 病原的分离与鉴定
    2010~2012年共检测疑似禽流感样品1707份，H9亚型AIV检测阳性261株，阳性率15.3%。见表1。

表1 2010~2012年H9亚型AIV分离情况

    2.2 H9亚型AIV HA区域核苷酸序列测定
    选择14株H9亚型AIV的HA区域进行核苷酸序列测定，其中2010年份分离的毒株测定了5株，2011年份分离的毒株测定了2株，2012年份分离的毒株测定了7株。应用 DNAStar 分析软件对测序结果进行拼接、分析，结果显示这些毒株 HA 基因由 1740-1744bp 核苷酸组成，没有核苷酸的插入和缺失，均含有一个完整的开发阅读框（ORF），大小均为 1683bp。
    2.3 核苷酸序列同源性比较
    测定核苷酸序列的14株毒株间 HA 基因核苷酸同源性为94.1-98.5%，另外，从 GenBank 中选取了 5 个 H9 亚型代表毒株及 3个我国普遍使用疫苗毒株的 HA 基因序列（见表2），与分离的14株毒株HA 基因进行了对比分析，见表3，14株分离株与选取的 8 株代表株的同源性统计，见表4。发现2010年到2012年这三年分离的14株毒株同源性较高，均在90%以上，而且与代表株中的Y280同源性最高，W66同源性最低。

表2 选用的H9亚型AIV代表株

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