监测流调

2010-2012年H9亚型AIV分子流行病学分析

日期:12-04 作者:宋姗姗等- 小 + 大

    1.5病毒RNA的提取
    参照 TRIzol®LS Reagent 的说明书稍加修改。具体如下:取含病毒的鸡胚尿囊液 200 µL,加 900 mL Trizol 裂解液,混匀,室温作用 10 min;加 200 µL 氯仿溶液,震荡混匀,室温作用 10 min;12 000 rpm,4℃离心10 min;小心吸取水相 600µL 加入到新的 DEPC 处理过的 1.5 mL 离心管中,加等体积的冰异丙醇溶液混匀,-20℃放置 10-15 min;12 000 rpm,4℃离心10 min,弃上清,加入 1 mL, 75%冰乙醇溶液,轻轻混匀洗涤;7500 rpm,4℃离心 5 min,弃上清,自然干燥后,加 30 µL DEPC 水溶解 RNA,-20℃保存备用。
    1.6 HA基因RT-PCR
    采用PrimeScript M-MLV RT-PCR Kit试剂盒进行RT-PCR反应,反应条件: 30℃ 10min, 42℃ 60 min, 72℃ 15 mim; PCR循环如下: 94℃ 4 min; 94℃ 45 s,52℃ 30s,72℃ 1min45s, 30次循环, 72℃10 min。
    1.7核苷酸序列测定
    PCR产物送往北京华大基因进行测序。
    1.8 H9亚型毒株的分子进化分析
    利用 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的 Influenza Virus Resource 数据库,搜索所有其收录的所有 H9 亚型 AIV 的 HA 基因序列,与测序结果一起进行在线 Alignment 初步对比后,利用 MEGA4.0 软件,初步绘制进化树,并选取代表毒株,继而进行近些年中国 H9 亚型 AIV毒株的 HA 基因的分子演化分析。
    2 结果
    2.1 病原的分离与鉴定
    2010~2012年共检测疑似禽流感样品1707份,H9亚型AIV检测阳性261株,阳性率15.3%。见表1。

表1 2010~2012年H9亚型AIV分离情况

 年份  检测数  阳性数  阳性率%
 2010  164  19  11.59
 2011  1220  190  15.57
 2012  323  52  16.10
 合计  1707  261  15.29

    2.2 H9亚型AIV HA区域核苷酸序列测定
    选择14株H9亚型AIV的HA区域进行核苷酸序列测定,其中2010年份分离的毒株测定了5株,2011年份分离的毒株测定了2株,2012年份分离的毒株测定了7株。应用 DNAStar 分析软件对测序结果进行拼接、分析,结果显示这些毒株 HA 基因由 1740-1744bp 核苷酸组成,没有核苷酸的插入和缺失,均含有一个完整的开发阅读框(ORF),大小均为 1683bp。
    2.3 核苷酸序列同源性比较
    测定核苷酸序列的14株毒株间 HA 基因核苷酸同源性为94.1-98.5%,另外,从 GenBank 中选取了 5 个 H9 亚型代表毒株及 3个我国普遍使用疫苗毒株的 HA 基因序列(见表2),与分离的14株毒株HA 基因进行了对比分析,见表3,14株分离株与选取的 8 株代表株的同源性统计,见表4。发现2010年到2012年这三年分离的14株毒株同源性较高,均在90%以上,而且与代表株中的Y280同源性最高,W66同源性最低。

表2 选用的H9亚型AIV代表株

 毒株   缩写   GenBank登录号
 A/Duck/HongKong/Y280/97  Y280  AF156376
 A/Chicken/Guangdong/SS/94  SS94  AF384557
 A/Chicken/Shandong/6/96  SD696  AF508570
 A/Chicken/Beijing/1/94  BJ94  AF156380
 A/Chicken/Shanghai/F/98  F98  AY743216
 A/Quail/HongKong/G1/97  G1  AF156378
 A/Duck/HongKong/Y439/97  Y439  AF156377
 A/Turkey/Wisconsin/1/1966  W66  DQ067444 

 

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