监测流调

2010-2012年H9亚型AIV分子流行病学分析

日期:12-04 作者:宋姗姗等- 小 + 大

宋姗姗 刘兴彩 冯敬敬 李建丽
(天津瑞普生物技术股份有限公司 300000)

    摘要:本研究对2010年到2012年我国河北、河南、江苏、安徽、山东、天津、湖北、湖南、山西、甘肃和四川等省市的养殖场的鸡群的喉、泄殖腔拭子进行了 H9 亚型 AIV 的病原学检测,共检测1707份样品,检测阳性率为15.29%。对检测H9 亚型 AIV阳性的病料进行病毒分离鉴定,并选取14株分离株进行HA基因序列比对,分析 HA 基因变异情况与分子进化特点与变化,丰富我国的 H9 亚型 AIV序列数据库,为H9亚型AIV的防控以及疫苗免疫提供参考依据。
    关键词:H9亚型禽流感,HA基因,基因进化分析

    禽流感(Avain Influenza,AI)是禽流行性感冒的简称,它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起禽类传染性疾病,主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病。根据对禽类致病力的高低,禽流感有分为高致病性禽流感(High Pathogenic Avain Influenza,HPAI)和低致病性禽流感(Low Pathogenic Avain Influenza,LPAI)或温和型禽流感(Mildly Pathogenic Avain Influenza,MPAI)[1]。
MPAI 虽不是烈性传染病,但因其基因来源丰富,分布广泛,对养禽业的危害也很大。而 MPAIV 中尤以 H9 亚型分布最为广泛、最具有危害性。虽然该亚型 AIV对禽群呈低致病力,主要临床表现仅为轻度呼吸道症状,但由于易与其他致病微生物发生协同作用,造成继发感染,从而引起了禽群的高发病率和致死率,对养禽业造成巨大损失。近几年,对我国部分省、市、区商品蛋鸡场及养鸡专业村进行禽流感血清学调查中发现,H9 亚型阳性鸡群占总的 AIV 抗体阳性鸡群的 93.67%,其中绝大部分是 H9N2 亚型 AIV[2],这说明 H9N2 亚型 AIV 在我国广泛存在,且流行情况较为复杂,存在着多个不同的基因型。由于其分布广泛并目呈逐渐蔓延之势,因此给养禽业造成的威胁是巨大的,严重制约了养禽业的发展。本研究对我国河北、河南、江苏、安徽、山东、天津、湖北、湖南、山西、甘肃和四川等省市的养殖场的鸡群的喉、泄殖腔拭子进行了 H9 亚型 AIV 的病原学检测,并进一步对分离出的部分 H9 亚型 AIV 的 HA 基因进行了全长扩增、测序与分析,绘制了 H9 亚 AIV 的 HA 基因系统进化树进行了分子进化分析。拟阐明这几个省份从2010年到2012年 H9 亚型AIV 的感染情况,分析 HA 基因变异情况与分子进化特点与变化,丰富我国的 H9 亚型 AIV序列数据库。
    1 材料与方法
    1.1 样品来源
    采集2009~2012年我国河北、河南、江苏、安徽、山东、天津、湖北、湖南、山西、甘肃和四川等省市养殖场疑似流感爆发鸡群的喉、泄殖腔拭子样品。
    1.2主要试剂和仪器
    RIzol®LS Reagent,PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2, DNA MarkerDL2 000均购于宝生物工程(大连)有限公司。
    超净工作台(美国 Forma Scientific)、低温冷冻离心机(德国eppendorf 5424R型)、PCR 扩增仪(美国Bio-rad T100)、微波炉(格兰仕)、紫外光凝胶成像系统(美国Bio-rad)。 
    1.3引物
    检测引物:按照农业行业标准《NYT772-2004 禽流感病毒 RT-PCR 试验方法》中对 H9 亚型禽流感病毒的 RT-PCR 检测方法的规定,选用 H9-732U/H9-732L 特异性引物扩增 H9 亚型血凝素基因片段,引物序列如下:
    H9-732U 5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′
    H9-732L 5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′
    由上海生工生物工程技术服务公司合成。
    HA 基因全长扩增引物根据 GenBank 上已经发表的禽流感病毒株参考序列设计扩增 HA 全长基因片段的引物,设计引物序列为:
    上游 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3’
    下游 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’
    由上海生工生物工程技术服务公司合成。
    1.4病毒分离鉴定
    将气管拭子在离心管中反复振荡;12 000 rpm 离心 5 min,上清液用微孔滤膜过滤除菌。滤液作为接种样品,尿囊腔接种两枚 9-11 日龄 SPF 鸡胚,每枚接种 200 µL,之后 37℃饱和湿度孵育,每 12 h 观察一次,弃去 24 h 内的死亡鸡胚,24-72 h 死亡和未死亡鸡胚 4℃放置过夜后,收集尿囊液,分装并置-70℃冰箱保存备用。根据鸡胚死亡情况和微量血凝实验方法(HA)来判断是否有病毒存在。将HA>1: 8的标本采用血凝抑制方法(HI)进行流感病毒型别鉴定(标准血清购自哈尔滨兽医研究所)。

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