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牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)在分类学上属黄病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒属(Pestivirus)成员，与属内的猪瘟病毒(classi—calswinefever virus，CSFV)及羊边界病毒(borderdiseasevirus，BDV)在血清学上有交叉反应。BVDV感染的牛能引起多种临床症状，如高热、腹泻、流涎、停食、白细胞减少、免疫抑制、黏膜充血等，还能引起奶牛产奶量下降，孕牛流产、产死胎及牛的持续性感染。野生反刍动物对BVDV非常敏感，尤其是鹿科动物更易感，在南达科他东南部的两头白尾鹿体内检测到了BVDV，并且在幼鹿中可持续感染。E2囊膜糖蛋白是BVDV抗原性的主要决定部分，同时又是变异率较高的一种结构蛋白，其变异可引起BVDV中和逃逸，导致动物持续感染。BVDV的检测方法也很多，Semrau等用荧光定量PCR对大量的样品进行了检测，结果发现从血清样品中检测到BVDV呈阳性的样品数量比口、鼻分泌物样品多。酶联免疫试验(ELISA)具有敏感、准确、快速、简单等优点，结合单抗应用具有很大的优势，抗BVDV单克隆抗体在牛病毒性腹泻病临床诊断，特别在研究BVDV抗原基因变异方面起着重要作用。我们在研究中用BVDVE2表达蛋白免疫Balb／c小鼠，研制出5株单抗，并在此基础上开展了抗原捕获ELISA(AC-ELISA)的研究工作。
材料与方法
1．1 病毒、单抗和阴性腹水
sf9昆虫细胞表达的BVDVE2蛋白来自军事兽医研究所病毒室，抗BVDV E2蛋白单克隆抗体4G3(ELISA效价1．8X10 5)自制。阴性腹水自制。
1．2 试验动物
1．5—2．0 kg的健康雌性家兔购自卫生部长春生物制品所，用于制备多抗。新生小牛购自长春市郊奶牛场，试验前检测BVDV为阴性，用于制备阴性小牛血清。
1．3 主要试剂
蛋白A凝胶(ProteinA Sepharose)及抗体纯化层析柱购自BIOTECH公司，HRP标记的羊抗兔IgG、邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等均购自SIGMA公司。细胞培养基Grace为GIBCOBRL公司的产品；PAGE低分子量蛋白Marker购自TAKARA公司；PEG600购自上海生物工程有限公司；BCA试剂盒购自Pierce公司。
1．4 单抗纯化鉴定
将IgM亚型的单抗4G3采用PEG6000纯化，纯化后的单抗用SDS-PAGE鉴定纯度和BCA试剂盒测定浓度后低温保存备用。
1．5 多抗的制备、纯化和浓度测定
以弗氏完全佐剂(FCA)乳化杆状病毒表达并纯化的BVDVE2蛋白免疫家兔，分点皮下注射1 000μg／只，共免疫3只。2周后以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化蛋白分点皮下注射相同剂量，最后一次免疫，直接用生理盐水稀释蛋白皮下注射1 000μg的重组E2蛋白抗原。2周后采血测抗体效价。待抗体达到要求后杀兔采血，分离血清。将兔血清采用蛋白A(Protein A Sepharose)柱层析法纯化，纯化后的IgG用SDS-PAGE鉴定纯度和BCA试剂盒测定浓度后低温保存备用。
1．6 NP-40处理制备BVDV抗原
将杆状病毒表达BVDV E2蛋白的sf9细胞接种至细胞培养瓶，待铺满整个瓶底时将细胞培养物反复冻融3次，1 503 g／min离心，收集细胞上清原液，加人1％细胞原液量含1％NP-40的PBS缓冲液，室温旋涡震荡1．5-2 h，然后601 g／min 4℃离心10min，上清作为被检阳性抗原，用同样方法处理的sf9细胞上清作为阴性对照。
1．7 单抗和多抗最佳使用浓度的筛选
采用方阵滴定法，将纯化后的单抗和多抗分别稀释至20 μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、2 μg／mL、1 μg／mL、0．5μg／mL 6个不同浓度，包被酶标板，4℃过夜后，以1％BSA的PBS溶液37℃封闭1 h，用0．15％吐温-20的PBS洗3次后加入NP-40处理的BVDV细胞培养抗原，同时加入同种方法处理的正常细胞培养物做阴性对照，37 ℃作用1 h；用含1％明胶的PBS溶液37 ℃封闭1h；加入不同浓度的兔抗BVDVIgG(20、10、5和2μg／mL)，37 ℃作用1 h；洗涤后加入羊抗兔酶标抗体(Sigma)，37 ℃作用1 h；再次洗涤后加入新配的底物溶液TMB+H2O2，37 ℃作用15 min；用2mol／LH2SO4溶液终止后检测OD450值，确定抗体的最佳工作浓度。
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