直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南

5.6.3.2 非 WGS 分析遗传修饰结构

对于无法获得 WGS 的酵母或丝状真菌，应对遗传修饰的所有步骤进行描述。所提供的信息应能识别所有可能引入受体/亲本微生物中的所有遗传物质。主要包括载体特征、遗传修饰过程、残留的载体或供体 DNA 结构及关注基因。

（1）载体特征

描述载体的来源和类型（质粒、噬菌体、病毒、转座子），若使用了辅助质粒，也应予以描述；提供所有功能元件和其他载体元件位置图谱，并附对该图谱详细阐述的表格，用以标识每个元件，包括编码和非编码序列、复制和转移的位点、调控元件、耐药基因及其大小、来源和作用等信息。

（2）遗传修饰过程信息

应对遗传修饰过程进行详细描述，包括 DNA 插入、缺失、替换或改造至受体/亲本的方法，以及筛选转基因微生物的方法；说明引入的 DNA 在微生物中的存在位置，明确插入基因是否在载体上，或是插入到染色体和/或真核微生物的细胞器（如线粒体）中。

（3）转基因微生物中残留的载体和/或供体核酸结构

详细说明实际插入、替换或修饰序列的位置图谱；对于序列缺失的情况，必须提供缺失区域的大小和功能。

（4）关注基因

对插入到转基因微生物中的任何关注基因（如耐药、毒素和毒力因子的编码基因）进行明确说明。

应通过试验证明转基因微生物中无不应存在的关注序列（如耐药基因、毒素和毒力因子的编码基因），包括遗传修饰过程中瞬时使用的序列（包括载体、辅助质粒），以及从中获取片段并用于转化的质粒/复制子中的序列，确定其中不含关注基因。

检测应采用适宜的方法，如 Southern 分析或 PCR 方法。

——Southern 印迹杂交验证应包括适宜的阳性和阴性对照。

应说明所使用探针的长度、位置，琼脂糖凝胶中 DNA 的上样量及印迹前的凝胶图像。阳性对照的浓度应为生产菌株每个基因组中靶片段的 1～10 个拷贝。若使用多个探针，则应采用独立的试验分别进行测定。

——PCR 试验应包括阳性对照和阴性对照。阳性对照应含有遗传修饰所使用的相同基因，还应包含适宜的阳性对照以排除PCR 抑制，确保试验灵敏度。

5.7 发酵制品中无生产菌株活细胞评价

发酵制品中应不含有生产菌株活细胞。详细描述生产过程中去除或灭活微生物的处理工艺步骤，并通过检测证明发酵制品中无生产菌株活细胞。

采用可培养方法检测产品中是否存在生产菌株活细胞。具体的采样、样品处理、培养条件、质控和鉴定要求见附录 D。对于由相同上游发酵工艺（包括发酵、提取等）生产的中间产品，经不同后处理工艺（如与载体或稀释剂混合、包被等）获得的不同配方添加剂产品，应至少对发酵中间产品进行评价。若为不同发酵生产体系生产的产品，应对每个添加剂产品分别评价。

5.8 发酵制品中生产菌株 DNA 检测

以下两类发酵制品应开展生产菌株 DNA 残留检测：

（1）生产菌株为非转基因微生物，但携带获得性耐药基因的；

（2）生产菌株为转基因微生物。采用特异 PCR 方法或其他标准方法对生产菌株 DNA 特异性片段（如获得性耐药基因、遗传修饰目的基因）进行检测。特异PCR 方法涉及的采样、DNA 提取、PCR 扩增和质控要求见附录 E。

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