直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南

5.3.3 动物致病性试验

制备直接饲喂微生物或发酵制品生产菌株的菌悬液，将其作为受试物，通过腹腔注射和经口灌胃等途径给予实验动物，评价不同暴露途径下受试物对实验动物的致病性。动物致病性试验应由农业农村部指定的评价试验机构，或具有相应 CMA 资质认定或 CNAS 实验室认可的第三方检测评价机构，按照相关行业已有方法开展。

5.3.4 产毒试验

对于丝状真菌，应在多种基质和条件下（单品种固体、多品种固体复合、不同成分液体组合等）进行产毒试验，并按照国家标准检测方法或国际组织规定的标准检测方法进行已知毒性化合物含量检测。对于发酵制品生产菌株，若产毒试验检测到已知毒性化合物，还应通过检测分析证明发酵制品中不含该化合物或该含量下风险无需关注。

5.3.5 结果分析

5.3.5.1 动物致病性试验显示受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡，或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异时，则判定菌株具有致病性。

5.3.5.2 产毒试验检测到已知毒性化合物时，则判定丝状真菌菌株具有产毒能力。

5.3.5.3 动物致病性试验显示无致病性的微生物，但存在以下情况的，需结合国内外文献资料综述、生产工艺、终产品中菌株和已知毒性化合物的存在情况等进行综合判断。

——WGS 分析显示存在已知毒力因子的编码基因（或产毒代谢相关基因）的细菌或酵母；

——产毒试验未检测到已知毒性化合物，但 WGS 分析显示存在产毒代谢相关基因的丝状真菌。

5.3.6 屎肠球菌的致病性评价

屎肠球菌（E. faecium）包括两个类群。其中一个类群主要由分离自健康个体粪便的菌株组成，其特征是对氨苄西林敏感。另一个类群包括了大部分的临床分离株，其特征是对氨苄西林耐药。除对氨苄西林耐药性进行评价外，致病岛标记基因 esp、类糖基水解酶基因 hylEfm 和标记物 IS16 也是屎肠球菌安全评价的关注点。

按照 5.4.1 的方法测定屎肠球菌的氨苄西林耐药性。

——若 MIC＞2 mg/L，则判定该菌株具有致病性危害。

——若 MIC≤2 mg/L，还应利用 WGS 分析是否含有遗传元件IS16、hylEfm 和 esp。若未检测到上述三种遗传元件，则判定该菌株不具有致病性危害。若检测到上述三种遗传元件中的一种或多种，则认为该菌株具有危害。

5.3.7 芽胞杆菌的致病性评价

蜡样芽胞杆菌群（Bacillus cereus group）的菌种普遍存在产毒能力，故不建议将其用于直接饲喂微生物和发酵制品生产。如确需使用，应对菌株进行 WGS 分析。若发现菌株具有肠毒素的编码基因（如非溶血性肠毒素基因 nhe、溶血素 BL 基因 hbl 和细胞毒素 K 基因 cytK 等）及呕吐素合成酶基因 ces 或相似基因，应证明该基因不具有功能性。具有产毒潜力的菌株具有危害。

对于蜡样芽胞杆菌群（Bacillus cereus group）以外的其他芽胞杆菌（Bacillus spp.），应通过开展细胞毒性试验来确定菌株是否产生高水平的非核糖体合成肽。因缺少可以区分有害和无害菌株的动物模型，采用基于细胞水平的体外试验方法（见附录 C）开展细胞毒性效应评价。

5.4 抗菌药物敏感性

直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株为细菌的，应开展抗菌药物敏感性评价。通过开展测定抗菌药物 MIC 值的表型试验和WGS 分析，评价菌株是否具有获得性耐药。

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