非洲猪瘟疫苗研究进展（一）

随着全基因测序技术的不断成熟以及ASFV基因功能的不断探索，通过基因敲除的方式制备ASF弱毒疫苗的可能性越来越大。目前最常用的技术手段是利用溶斑识别和筛选技术进行基因突变。由于基因敲除的变化不是点突变，因此毒力更稳定，毒力返强几率也更小。对于ASFV，目前备受关注的基因主要是那些删除后会导致病毒毒力降低或增加机体免疫反应的功能基因。例如，多基因家族360和530里面的基因，参与到核苷酸代谢的胸苷激酶基因（Thymidine kinase，TK）和B119L或9GL基因。这些基因删除后通过降低病毒在巨噬细胞的繁殖能力进而达到降低病毒毒力的目的。还有些基因虽然删除后不能降低病毒在巨噬细胞的繁殖能力，但也能减低病毒在猪体内的毒力。例如，删除DP71L基因（也命名为114L，NL，NLS）和DP96R（也命名为UK）毒力基因也可以降低病毒的毒力。相反，有一些涉及免疫逃避的基因被删除后不能降低病毒毒力。例如，编码 A238L蛋白、CD2v 蛋白、C-型凝集素(C-type lectin)和细胞凋亡抑制因子的基因被删除后并没有降低病毒在猪体内的毒力，但仍有希望作为弱毒疫苗的删除基因，因为这些基因删除后可能会对猪产生适当的保护反应。

3、亚单位疫苗

ASF亚单位疫苗的研究策略主要是将具有中和表位的非洲猪瘟病毒保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞，以诱导产生高滴度的抗非洲猪瘟病毒的中和抗体。ASFV编码的结构蛋白很多，但恢复期猪血清显示P72，P30和P54为感染过程中引起体液免疫应答最重要的3个抗原蛋白。针对P72和P54的抗体可以阻止病毒吸附，针对P30的抗体可以阻止病毒内吞。目前大量的研究已经证实将这三个蛋白作为ASF亚单位疫苗具有一定的局限性。Paulino等采用重组杆状病毒表达的p30和p54蛋白制备的疫苗仅能提供50%的保护，Barderas等表达的P54/30重组蛋白仅可以延缓临床症状的出现和降低病毒血症的滴度，Neilan等证实将p30、p54和p72免疫后不能提供免疫保护，仅能延缓临床症状出现时间和降低病毒血症水平。针对其他ASFV蛋白的研究也证实了单纯的将蛋白作为疫苗使用的不足，如将2只ASFV血凝素蛋白免疫猪与ASFV强毒感染猪混合饲养，1只死亡，1只存活；杆状病毒表达的CD2v蛋白只能提供部分保护[50]；经抗原分析后人工合成的ASFV肽段只能延缓病程；病毒结合蛋白P12的抗血清在体外实验中不能降低病毒感染，不能阻止ASFV与易感细胞结合或中和病毒等。这些试验说明面对ASFV众多的抗原结构蛋白和复杂的免疫刺激过程，单纯依靠一个或几个蛋白很难达到免疫预防效果。

4、DNA疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在宿主细胞的表达系统内合成抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的特异性的体液免疫和细胞免疫应答，以达到预防和治疗疫病的目的。作为新一代的疫苗研制方向，ASFV的相关研究也已经开始。J.M. Argilaguet等将 P30和P54连入真核表达质粒pCMV-PQ，结果该DNA疫苗免疫猪后无法抵御强毒株的攻击。随后，该实验室又进一步将ASFV血凝素蛋白基因和泛素基因连入上述DNA疫苗中，结果仍不能达到完全保护的功效。为进一步研究能刺激CD8+ T细胞的潜在免疫保护区，Anna Lacasta等通过表达文库构建了4029个表达质粒（ASFVUblib）并对其进行了免疫攻毒保护试验，结果保护率仍只达到60%。虽然目前研制的DNA疫苗还不能抵御强毒攻击，但ASFVUblib免疫攻毒后存活的猪无排毒现象，这个研究结果标志着距离开发出有效的ASF疫苗又迈出了一大步。相信随着ASFV基因组及保护性抗原的不断深入研究以及表达载体的不断改造优化，DNA疫苗一定会在未来ASF疫苗市场上占据一席之地。

5、其他新型疫苗

复制缺陷型病毒疫苗是近些年倍受关注的新型疫苗研制方向。ASF复制缺陷型疫苗是采用基因工程方法，将非洲猪瘟弱毒株复制过程中的一些必须基因进行缺失，使其只能在提供复制必需基因的辅助细胞系中才能进行有效复制，在感染动物后不能进行有效复制，故该疫苗毒最大程度的保留了病毒的原始状态，保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性且在感染动物中不会产生排毒等免疫副作用。虽然目前还无更详细的专业报道，但有报道称西班牙马德里Severo Ochoa分子生物学中心(CBMSO)的研究人员已经开始研发，其实验室也于2012年将通过抑制pp220、pp62和pB438L基因产生ASF复制缺陷性病毒的研究申请专利。

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