非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技术研究进展

2、CRISPR可以高效构建重组ASFV并易于重组病毒的纯化

ASFV对稳定细胞系适应后，会引起病毒基因组的大部分区域自发缺失，导致病毒毒力严重致弱，丧失对同源亲本毒株攻击的保护能力。因此，为了保持病毒基因组的稳定性，必须在猪巨噬细胞的原代细胞培养物中产生重组ASFV。重组ASFV的构建通常依靠通过靶向基因的两侧向ASFV导入含有同源重组臂的质粒，并用质粒中的报告基因取代靶向基因。这种同源重组方法，尤其是在猪巨噬细胞培养中进行的同源重组方案，重组效率非常低，野生病毒背景高，难以纯化重组ASFV，需要进行多轮空斑纯化或有限稀释。

2018年，Borca等采用CRISPR/Cas9诱导Cas9双链断裂ASFV基因组中8-DR的开放阅读框（open reading flame, ORF），在猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages, PAM）中从Georgia07毒株的基因组中删除非必需基因8-DR，并用红色荧光蛋白（red fluorecent protein, RFP）基因替代。敲入质粒中包含左臂8-DR ORF上游区域（72 169bp~73 369bp）和右臂8-DR ORF的下游区域（74 454bp~75 653bp），插入片段为RFP和Blasticidin基因（图1）。设计相关gRNAs，克隆入pCAS-Guide载体（来自Blue Heron Biotech公司）中。随后，在感染野生病毒的PAM细胞中，将两种8DR靶向gRNAs载体与敲入载体共转染，使用CRISPR/Cas9系统后，在转染后24 h，检测到约4log10 TCID50的重组ASFV。而对比传统的同源重组技术，获得的重组病毒低于滴定检测限（<0.5Log10TCID50），但通过细胞盲传，可以检测到荧光表达，获得重组病毒。这些结果表明使用CRISPR/Cas9比传统的同源重组技术的重组效率明显提升。该方法有效地构建ASFV重组病毒，通过对比试验发现，该技术相对于同源重组方法，能够显著提高重组ASFV，并易于重组病毒的纯化。结果表明，使用CRISPR技术编辑ASFV基因组已经成为了可能。

采用有限稀释法对CRISPR/Cas9敲除的ASFV Georgia病毒进行纯化，利用感染后荧光细胞来监测纯化，结果发现，使用CRISPR/Cas9系统明显增加重组病毒重组效率，比使用传统同源重组方法的纯化过程更容易，仅经过5次有限稀释，即可获得纯化子，这比使用传统的同源重组方法纯化ASFV所需的时间缩短很多。

3、pX330-ΔNLS1/2neoR载体构建以及稳定表达gRNA野猪肺细胞系建立

pX330-ΔNLS1/2neoR载体构建 为了鉴定和克隆ASFV基因组中合适的CRISPR/Cas9靶序列，需要构建合适的载体。有研究人员使用载体质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas920。该载体质粒最初被设计用于编辑哺乳动物基因组，在Cas9 ORF的两端编码核定位信号（nuclear localization signal, NLS）。由于ASFV主要在受感染细胞的细胞质中复制，因此需去除Cas9的NLS。在去除两端的NLS之后，插入新霉素抗性基因，从而构建获得pX330-ΔNLS1/2neoR载体。而NLS-less Cas9载体已被成功应用于痘苗病毒的定向突变。

稳定表达gRNA的野猪肺细胞系（wild boar lung cell line, WSL）建立  靶向P72和核酸酶的gRNA序列插入至pX330-ΔNLS1/2neoR载体中，将质粒分别转染野猪肺细胞系（WSL），新霉素抗性筛选细胞，通过Western blot、PCR和基因组DNA测序检测Cas9表达。结果表明，特异性gRNA在多次（>50）传代中稳定表达，且未发生Cas9核酸酶的脱靶反应。在该细胞系中，ASFV复制明显受到抑制。CRISPR/Cas9系统还有助于从病毒基因组中特异性地删除CP204L（P30）和其他必需的或非必需的ASFV基因。必需基因敲除时，为了避免病毒不能复制，可以通过共转染基因表达质粒的互补实验来姆弥补。该策略不仅有助于阐明病毒基因功能，也适合作为减毒或单循环活疫苗。非洲猪瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路，更多ASFV基因的敲除研究工作正在进行之中。

2018年8月3日，中国辽宁省沈阳市确诊国内首例非洲猪瘟疫情。8月16日河南省郑州市经济开发区某食品公司屠宰场发生一起生猪非洲猪瘟疫情。8月19日，江苏省连云港市海州区发生一起生猪非洲猪瘟疫情。每起疫情一经确诊，应急响应机制立即被启动，通过采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，禁止所有生猪及易感动物和产品运入或流出封锁区，疫情均已得到有效控制。疫情的不断发生说明非洲猪瘟的基础致病性研究和储备性疫苗的研究工作已经迫在眉睫。而CRISPR也许就是打开ASFV疫苗研制这扇门的一把钥匙，CRISPR技术的应用为非洲猪瘟病毒的基础致病性研究带来了曙光，也为研制非洲猪瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路，更多ASFV基因的敲除研究工作正在进行之中。

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