悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析

时间：2013-07-11 点击：次来源：阳光畜牧网作者：阳光畜牧网 - 小 + 大

    2.2实验方法
    2.2.1 转瓶培养Vero细胞生产狂犬病毒
    将复苏的Vero细胞在T75培养瓶中使用低血清培养基（含5％血清）培养，连续传代扩增至15L转瓶，传代比例1:4~1:5，每3天传代一次，培养细胞成良好单层换病毒维持液，按一定比例接种狂犬病毒进行维持培养，根据细胞病变维持情况进行连续收获病毒液3~4次。
    2.2.2 反应器微载体培养Vero细胞生产狂犬病毒
    （1）种子细胞扩增：将复苏的Vero细胞在T75培养瓶中使用MD504培养基（含5％血清）培养3代，扩增至15L转瓶。消化收集转瓶细胞，接种5L反应器进行微载体培养，待微载体上细胞长满，反应器在线消化细胞后接种120L反应器进行微载体低血清培养基（MD505，含5％血清）培养，工作体积70L，微载体浓度5g/L 。培养方式为灌流培养，控制反应器温度、pH、溶氧（DO）、搅拌转速、灌流速率等参数，定期在线无菌取样，观察细胞生长状况，细胞计数采用结晶紫-柠檬酸染色法[5]。
    （2）反应器培养病毒：待120L反应器微载体细胞长满后按MOI＝0.025~0.1的比例接种狂犬病毒，控制反应器温度在35℃、pH在7.4~7.6、溶氧（DO）在20~60％、搅拌转速在30~80r/min、灌流速率在每天0.5~2罐体积等，隔天无菌取样，观察细胞维持情况并留样检测病毒滴度（LD50），以确定维持液灌流速率及病毒收获方式。
    2.3 细胞培养结果对比
    15L转瓶和反应器微载体培养Vero细胞，分别结合相应的低血清培养基，在培养不同时间对细胞的状态和细胞的数量进行观察，结果详见表4。

表4 转瓶培养和反应器微载体培养Vero细胞对比情况

项目	转瓶培养	反应器微载体培养
工作体积（L）	1.5	70
细胞培养基（均为个性化培养基）	低血清培养基	反应器用低血清培养基
血清使用量	5%	5%
微载体用量	—	5g/l
培养工艺	—	灌注培养
细胞接种密度（cells/ml）	0.25×10⁶	0.4×10⁶
细胞状态（48hr）	细胞汇合率70%左右	部分微载体上细胞长满
细胞状态（72hr）	细胞成单层	大部分微载体上细胞长满
细胞密度（96hr）（cells/ml）	1.1×10⁶	3.2×10⁶
细胞密度（144hr）（cells/ml）	1.5×10⁶	3.8×10⁶

图3转瓶低血清培养72hr，100X

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