动物布鲁氏菌病诊断技术标准

4　动物布病试管凝集试验

4.1　材料准备

4.1.1　稀释液

0.5%石炭酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释应用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。

4.1.2　抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。

4.1.3　凝集试验管(三分管)、试管架、吸管及温箱。

4.2　操作方法

4.2.1　按常规方法采血分离血清。

4.2.2　运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，按每9mL血清加1ml 5%石炭酸生理盐水(徐徐加入)防腐，也可用冷藏方法运送血清。

4.2.3　受检血清的稀释

以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。

4.2.3.1　第一管标记检验编码后加1.15mL稀释液。

4.2.3.2　第2—4管各加入0.5mL稀释液。

4.2.3.3　然后用1ml吸管取被检血清0.1mL；加入第1管内，并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸人吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸入、吹出3—4次，充分混匀后以该吸管吸混合液0.25ml弃去，

4.2.3.4　取0.5mL混合液加入第2管，用该吸管如前述方法混合。

4.2.3.5　再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5mL。

4.2.3.6　稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1：125、1：25、1：50和1：100。

4.2.3.7　牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第一管加1.2mL稀释液和0.05mL被检血清。

4.2.3.8　将0.5mL20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1：25、1：50、1：100和1：200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1：50、1：100、1：200和1：400。 大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1：50和1：100，猪、山羊、绵羊和狗用1：25和1：50。

4.2.3.9　 置37℃—40℃温箱24h，取出检查并记录结果。

4.2.3.10　每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即

a)阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

b)阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同。

c)抗原对照：1：20稀释抗原液0.5mL，再加0.5mL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

4.3　判定

4.3.1　供判定参照比浊管制备方法见附录E(提示的附录)。

4.3.2　结果判定

4.3.2.1　凝集反应程度分为：

参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读

a)++++菌体完全凝集，100％下沉，上层液体100％清亮；

b)+++菌体几乎完全凝集，上层液体75％清亮；

c)++菌体凝集显著，液体50％清亮；

d)+凝集物有沉淀，液体25％清亮；

e)—凝集物无沉淀，液体均匀混浊。

4.3.2.2　牛、马、鹿和骆驼1：100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1：50血清稀释，出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。

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