时间：2010-05-16 点击： 次 来源：中国猪网 作者：阳光畜牧网 - 小 + 大
| 猪瘟（slassical swine fever ，CFS）以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局（Office of International des E’pizooties，OIE）列为A类动物传染病。在世界许多国家和地区，传统疫苗接种是控制猪瘟的重要手段。目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法国的Thireval疫苗。我国的猪瘟兔化弱毒疫苗性能稳定、安全、免疫效果好，且无残留能力，是国际公认的唯一安全有效的弱毒疫苗，亦是国内唯一应用的弱毒疫苗。 20世纪70年代后期，猪瘟的流行形式发生了很大变化。地区散发性流行及非典型猪瘟症状的发生，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测时发现有不同的反应模式，猪瘟免疫屡屡失败等，表明猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的抗原性可能存在着变异，从而使有人对传统弱毒疫苗提出了质疑。随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖，疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移；加之数十年来CSFV在大规模免疫接种压力下可能出现抗原变异。这些情况都表明，现有的传统疫苗已不能适应新形势的需要，研究和开发新型猪瘟疫苗机是大势所趋。分子生物学技术的兴起和发展，为新型猪瘟 疫苗的研究和开发奠定了基础。1．开发新型猪瘟疫苗的分子生物学基础CSFV是一种小（40-60nm）的有囊膜病毒，含有单股正链RNA基因组。CSFV基因组长约12.5kb，由一个大的开放性阅读框架（open reading frame，ORF）和两侧的5’-端非翻译区（5’-UTR）和3’-端非翻译区（3’-UTR）构成。编码蛋白顺序为Npro、C、Erns （E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3（P80）。除C、Erns 、E1和E2为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是Erns 和E2。 Erns 由227个氨基酸残基构成，分子量约为44-48ku，可诱导产生中和谱很窄的中和抗体。Erns 没有疏水的膜锚定结构，为可分泌蛋白。它在由细胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒颗粒囊膜上并不稳定，在细胞培养CSFV的上清液中含有少量的病毒粒子，但却含有大量被分泌出的Erns 。Erns 不仅是一种结构蛋白，而且也是一种功能性蛋白，它与CSFV对宿主细胞的嗜性以及致病力有密切关系。Erns 有RNase活性，可降解病毒和细胞的RNA。Erns 可导致免疫抑制，引起动物的淋巴和上皮细胞刁亡。CSFV的宿主嗜性也与Erns有关，用Erns中和单抗可有效阻断CSFV对易感动物细胞的感染。Erns还表现出神经细胞毒性和抗凝集活性，CSFV感染动物后所产生的Erns蛋白在致病过程中起重要作用。 E2的分子量约为53-55ku。E2参与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，起编码的gp55蛋白是猪瘟的主要保护性抗原。靠近C端的疏水区为gp55的膜锚定结构（TMR），从856位半胱氨酸（Cys）后的第6个氨基酸至C端TMR之间形成有弹性的α螺旋结构，没有抗原决定簇。从N端693位至856位Cys之间形成富含抗原决定簇的2个抗原结构域，这2个结构域由位于737和792位Cys之间的一段片β片层结构隔开。693和737位Cys形成二硫键并组成一个序列非保守性抗原结构域，具有中和性的B、C抗原区位于该结构域中，另一个结构域属序列保守性，由792和856位Cys形成的二硫键组成，包含中和抗原区A和非中和抗原区D，而A和D区由其间的一个疏水区和818位、828位Cys形成的二硫键分开。在A、B、C3个中和区中，各有一段与中和性密切相关的高频突变序列或位点。这些序列或位点的突变株将逃脱中和性单抗的中和作用，免疫血清对对这类突变株的中和作用也会降低。 全长感染性cDNA克隆技术使笔者得到了纯粹的CSFV基因组。这一成果为进一步研究CSFV的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机理、致病机理、基因产物的功能、特异性诊断、宿主嗜性以及DNA疫苗和标记疫苗的开发等，打下了坚实的基础。目前为止，已经成功构建了CSFV C-株、Brescia-株和Alfort/187-株等全长感染性cDNA。2．新型猪瘟疫苗的研究和应用前景2.1 CSFV基因缺失型弱毒疫苗通过非天然宿主传代选择得到的突变株，其基因组可发生多个突变。当某些一病毒复制无关的毒力或相关基因缺失突变后，其毒力丧失或明显减弱，但病毒复制能力并不丧失，同时保持着良好的免疫原性。因此，通过基因工程技术致使病毒基因组中负责毒力的基因缺失，可以获得基因缺失型弱毒疫苗株。 由于许多从RNA病毒获得的cDNA具有感染性，所以人们预测RNA病毒缺失株的研究也将逐步开展。由于缺失型弱毒苗是人为地将病毒的毒力基因切除，往往不可能完全自行修复，因而不会发生返祖现象，在遗传特性上比较稳定，是今后弱毒疫苗的研究方向之一。采用缺失的方法可能会制造出免疫原性好，且在安全性上更有保证的弱毒疫苗株，也可以改造现行的免疫原性还不能令人满意的弱毒株以增强其安全性。2.2 CSFV亚单位疫苗 应用化学的方法从病毒粒子中分离出保护性抗原可以制成亚单疫苗。亚单位疫苗是病毒粒子的一部分，不含有核酸，非常安全。亚单位疫苗的免疫原性通常较低，需要与佐剂合用，或偶联到适当的载体上应用。从完整病毒粒子上制备具有免疫原性的亚单位疫苗时，由于抗原量的限制，制备过程复杂，成本往往比较高。因此，采用基因工程的方法，不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因，而且能够在体外对其进行改造或修饰，并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，使病毒蛋白获得大量表达。利用真核细胞高效表达系统来表达CSFV免疫原蛋白，并以此表达产物为抗原可获得基因工程亚单位疫苗。 Hulist等将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒（AcNPV），并在sf21细胞中表达。用20-100ug的表达蛋白免疫猪，可抵抗100LD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前，该蛋白的表达水平已被提高至60ug/mL，并且该疫苗于1998面被列入欧洲药典。许多研究者对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验，证明其对猪有良好的保护作用，但是不能有效防止猪瘟病毒的传播。 |
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